尚常花，朱順妮，王忠銘，袁振宏，謝 君（. 華南農業(yè)大學新能源與新材料研究所，農業(yè)部能源植物資源與利用重點實驗室，廣東省普通高等學校生物質能源重點實驗室，廣州 5064；. 中國科學院廣州能源研究所，廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應用重點實驗室，中國科學院可再生能源重點實驗室，廣州 50640）

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微藻培養(yǎng)方法研究進展*

尚?；?，2，朱順妮2，王忠銘2，袁振宏2，謝 君1?
（1. 華南農業(yè)大學新能源與新材料研究所，農業(yè)部能源植物資源與利用重點實驗室，廣東省普通高等學校生物質能源重點實驗室，廣州 510642；2. 中國科學院廣州能源研究所，廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應用重點實驗室，中國科學院可再生能源重點實驗室，廣州 510640）

摘 要：微藻是一種有前景的生物柴油原料。微藻培養(yǎng)是微藻生物柴油生產過程的重要環(huán)節(jié)。本文就微藻培養(yǎng)方法的研究進展進行了闡述。對自養(yǎng)、異養(yǎng)及兼養(yǎng)三種培養(yǎng)方法進行了比較，并對微藻培養(yǎng)提出了建議。

關鍵詞：微藻；生物柴油；培養(yǎng)方法

0 引 言

石油的利用極大促進了社會的發(fā)展。然而，日益減少的儲量和燃燒導致的環(huán)境污染，使得全球面臨著能源短缺和環(huán)境惡化的雙重危機［1-2］。因此，尋求清潔可持續(xù)發(fā)展的新能源引起了廣泛關注。

生物柴油是一種清潔的可再生能源，是以大豆油菜、麻風樹、油棕、黃連木等高等植物、微藻油脂、動物油脂及地溝油等為原料制成的可再生柴油燃料［1-3］。與石油柴油相比，生物柴油具有易生物降解、可再生、對環(huán)境友好等優(yōu)點，可部分替代石油柴油［1-2，4-5］。目前，受原料供應不足及成本較高的雙重限制，生物柴油的實用化還有一定困難。原料成本約占生物柴油生產成本的50% ～ 85%［4，6］，因此利用廉價原料是降低生物柴油生產成本的關鍵之一。草本油料作物的含油量較高，收獲的種子存儲和加工較簡便，但中國食用植物油脂的缺口較大，不可能出現足量剩余植物油用來發(fā)展生物柴油。木本油料植物的含油果實一般每年只能收獲一次，而且存儲的成本較高，以其為原料來生產生物柴油受到季節(jié)限制。與其他原料相比，微藻具有光合作用效率較高、生長較快、不占用農田、生物量較高、油脂含量較高等優(yōu)點，其油脂組成與植物油相似［1］。

微藻制取生物柴油是目前國際新能源領域的新方向。隨著現代工業(yè)生物技術的發(fā)展，已獲得更多具有高產油能力或其抗菌能力強的產油微藻資源，提高了微藻產油的效率。本文就微藻培養(yǎng)的內容進行闡述。

1 光能自養(yǎng)培養(yǎng)

在光能自養(yǎng)培養(yǎng)中，微藻利用光照（自然光或人工光照）和無機物（H2O、無機鹽和 CO2）進行光合作用，合成有機物，維持自身生長。由于微藻都可以進行光合作用，因此光能自養(yǎng)是廣泛采用的一種微藻培養(yǎng)方式［7］。在自養(yǎng)條件下，微藻的油脂含量因藻種的不同變化幅度很大。GOUVEIA等［8］報道自養(yǎng)條件下Spirulina maxima LB 2342的油脂含量僅為4.1%。TAKAGI等［9］報道Dunaliella tertiolecta ATCC 30929在自養(yǎng)條件下油脂含量高達 60.6% ～67.8%。

國內外學者對影響微藻油脂合成的環(huán)境因素進行了較多研究。MCLARNON-RICHES等［10］發(fā)現光照、溫度和重金屬離子（Cu2+、Zn2+）可改變羊角月芽藻中油脂的脂肪酸比例。TAKAGI等［9］發(fā)現NaCl濃度為0.5 ～ 1.0 M時，隨濃度升高鹽藻Dunaliella tertiolecta的油脂含量從60%增加到67%。

在諸多環(huán)境因素中，氮源濃度的影響最顯著。在微藻自養(yǎng)培養(yǎng)中，氮缺乏廣泛用于將微藻中代謝流導向油脂合成。前人關于氮缺乏影響微藻油脂積累的報道較多。MUJTABA等［11］發(fā)現在氮缺乏條件下產油微藻Chlorella vulgaris培養(yǎng)12 h后油脂含量達到43%，而在氮源充足條件下培養(yǎng)24 h后油脂含量僅為53%。PANCHA等［12］報道了氮缺乏條件對微藻Scenedesmus sp. CCNM 1077形態(tài)及細胞內生化過程的影響，結果表明氮限制明顯降低了細胞的光合活性和粗蛋白含量，影響了細胞的形態(tài)，增加了油脂含量（培養(yǎng)15 d后氮缺乏條件下為27.93%，氮源充足條件下為18.87%）。RIOS等［13］發(fā)現與氮源充足條件相比較，在氮限制條件下培養(yǎng)7d后，微藻Desmodesmus sp.的油脂含量最高，為23%。LIU等［14］發(fā)現氮缺乏條件下可以獲得最高的油脂生產速率305.71 mg·L-1·d-1，同時伴隨著蛋白質、葉綠素和DNA等含氮化合物的降解。LI等［15］設計了氮缺乏、磷缺乏、氮和磷都缺乏及氮和磷都充足四個實驗組來考察營養(yǎng)缺乏對Chlorella protothecoides油脂積累的影響，結果表明氮和磷都缺乏條件下油脂含量最高為55.8%，其次是氮缺乏條件下油脂含量為52.5%。氮缺乏不僅可用于自養(yǎng)過程，而且也可用于異養(yǎng)和兼養(yǎng)過程，是一種廣泛使用的手段。雖然關于氮限制在微藻中誘導油脂積累的報道很多，然而從分子水平對此現象進行解析的報道非常少，有一些從蛋白和代謝物水平研究氮缺乏的報道［16-18］。MICHAEL等［19］解析了Chlorella vulgaris strain UTEX 395在氮源充足和氮缺乏條件下在轉錄組和蛋白組水平的變化，重點研究了三脂酰甘油合成途徑在基因和蛋白水平的變化，為深入理解對氮限制的響應機制及改良該藻奠定了基礎。RISMANI-YAZDI等［20］測定了Dunaliella tertiolecta的轉錄組，構建了生物燃料前提分子的代謝途徑，為改良微藻奠定了基礎。本實驗室在前期研究中分析了氮缺乏和氮源充足條件下Dunaliella parva轉錄組的變化，構建了脂肪酸、三脂酰甘油及淀粉等物質的代謝途徑，發(fā)現了重要的響應氮缺乏的轉錄因子基因wri1，為后繼深入研究奠定了良好的基礎［21］。

光能自養(yǎng)培養(yǎng)可以在封閉式光生物反應器或者跑道式開放塘中進行。封閉式光生物反應器的優(yōu)點包括：①與跑道式開放塘相比損失的水分很少；②培養(yǎng)系統(tǒng)可維持較長時間；③可以實現高密度培養(yǎng)。跑道式開放塘的優(yōu)點包括：①蒸發(fā)降溫；②成本低。封閉式光生物反應器的缺點包括：①難以擴大規(guī)模；②需要控制溫度；③需要定期清理；④微藻在光生物反應器中生長時會產生大量的溶解氧，需要利用專門的脫氣系統(tǒng)對溶解氧進行有效的釋放；⑤藻細胞容易附著到光生物反應器的壁上，降低培養(yǎng)效率，需要通過通氣或者加大流速來緩解這一問題。跑道式開放塘的缺點包括：①受外界溫度及濕度變化影響較大；②難以保持純種培養(yǎng)。

光源和光強是影響微藻生長的重要因素。為了增加微藻的生長及降低建設成本，研究者通過材料改良和工程設計改善在封閉式光生物反應器的改造方面做了很多嘗試。目前，封閉式光生物反應器的類型主要包括：管道式光生物反應器（圖1）［22］、平板式光生物反應器（圖 2）［23］、柱狀氣升式光生物反應器（內導流氣升式反應器、光導纖維光生物反應器及磁處理氣升式光生物反應器）和發(fā)酵罐式光生物反應器。全封閉管道式光生物反應器具有高度集約化生產、高光合效率、高產率等特點，且操作簡便，易于管理。袁振宏等［24］設計了一種高密度培養(yǎng)微藻的太陽能分光光合生物反應器系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用光纖將太陽光導入到光生物反應器，實現微藻的高效培養(yǎng)。王忠銘等［25］設計了一套利用含油廢氣篩選與培育微藻的裝置，用于實驗室水平的微藻培養(yǎng)和篩選。秦磊等［26］設計了用于跑道池培養(yǎng)微藻的高壓微噴補碳系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于戶外大規(guī)模培養(yǎng)微藻時的碳源補充，可促進微藻的生長。

圖1 管道式光生物反應器示意圖Fig. 1 Schematic diagram of tubular panel photobioreactor

圖2 平板式光生物反應器示意圖Fig. 2 Schematic diagram of flat panel photobioreactor

可用于微藻自養(yǎng)培養(yǎng)的光源包括：日光、傳統(tǒng)的人工光源、LED光源及光纖。目前，LED光源受到廣泛的關注。LED光源使用壽命長、發(fā)光效率高、耗電量少，耐受頻繁的開啟和關閉及安全可靠性強。此外，LED光源體積小，可以隨意組合，易于開發(fā)成輕便短小型照明產品，便于安裝到各種形狀的光生物反應器中。典型的LED的光譜范圍都比較窄，因此，LED光源可以隨意進行多樣化的搭配組合。

2 異養(yǎng)培養(yǎng)

微藻異養(yǎng)培養(yǎng)是指在黑暗條件下微藻利用外加的碳源進行培養(yǎng)。該技術可以克服跑道式開放塘養(yǎng)殖和封閉式光生物反應器培養(yǎng)的缺點，具有生長更快、有利于純種培養(yǎng)、產量高、便于自動化控制等優(yōu)點。因此，近年來微藻異養(yǎng)培養(yǎng)技術成為研究熱點。據報道，已有近百種微藻可以進行異養(yǎng)生長［27-28］。吳慶余教授等［1，29-30］異養(yǎng)培養(yǎng)原始小球藻（Chlorella protothecoides）以生產油脂，外加的碳源是葡萄糖。異養(yǎng)培養(yǎng)的原始小球藻（Chlorella protothecoides）油脂含量可高達細胞干重的55.20%，大約是自養(yǎng)細胞油脂含量（14.57%）的4倍［29］。繆曉玲等［31］利用異養(yǎng)的原始小球藻中獲得的油脂，經酯交換反應生產生物柴油，其特性與傳統(tǒng)柴油相似。目前，可用于微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的碳源主要有糖類（例如葡萄糖）、醋酸鹽以及有機酸等。尹建云等［32］首先用淀粉酶和糖化酶對玉米淀粉進行酶解，然后利用酶解產生的糖作為碳源，對普通小球藻（Chlorella vulgaris）進行異養(yǎng)培養(yǎng)。DE SWAAF等［33］進行寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii）的異養(yǎng)培養(yǎng)時，分別添加葡萄糖和醋酸作為碳源。結果表明：添加50%（w/w）醋酸時，多不飽和脂肪酸DHA含量為38 mg·L-1·h-1，遠高于添加50%（w/v）葡萄糖時的DHA產量，為14 mg·L-1·h-1。

近期，研究人員對微藻異養(yǎng)生長可利用的碳源種類進行了進一步的探索。SHEN等［34］在氮限制條件下以葡萄糖作為碳源對微藻 Chlorella vulgaris NIES-227進行異養(yǎng)培養(yǎng)，獲得了很高的COD轉化率（1 g葡萄糖可產0.88 g油脂）及很高的脂肪酸甲酯含量（89%）。HENA等［35］使用三階段培養(yǎng)過程對一株高產油微藻Chlorella sorokiniana DS6在奶牛場廢水中進行異養(yǎng)培養(yǎng)，用于生產生物柴油。LEITE等［36］對10株微藻進行了篩選，發(fā)現部分藻株可在含甘油或者木糖的培養(yǎng)基中生長，在含木糖培養(yǎng)基中異養(yǎng)生長時，其生長速率為自養(yǎng)條件下的2.8倍，且油脂產量也明顯高于自養(yǎng)條件。木糖是造紙廠廢水的主要碳源，這表明這些微藻有可能用于處理造紙廠廢水同時積累油脂。

綜上所述，研究人員已經對更廣范圍、更廉價的用于微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的碳源進行了探索，這有利于將來降低微藻生物柴油的生產成本。

3 兼養(yǎng)培養(yǎng)

除了自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)，近年來兼養(yǎng)培養(yǎng)逐漸引起研究人員的關注。當對特定種類的微藻同時提供CO2和有機碳源時，微藻可進行兼養(yǎng)生長。味精廠產生的廢水具有高COD、高NH3-N及高硫酸鹽等特點，直接排放會對環(huán)境造成嚴重污染。山東大學的紀雁［37］利用味精廢水培養(yǎng)普通小球藻進行兼養(yǎng)生長，考察了營養(yǎng)物質濃度及光照強度等因素對普通小球藻生長速率及生物質組成的影響，既可以降低微藻生產成本，又可以解決有機廢水造成環(huán)境污染的問題。內蒙古科技大學的廖利民［38］研究了城市生活廢水滅菌、營養(yǎng)鹽補加對富油柵藻XJ002生長和油脂積累的影響。結果表明：XJ002能夠在未滅菌的城市生活廢水中生長。暨南大學的沈丹丹［39］研究了富含油脂的尖狀柵藻（Scenedesmus acuminatus）和富含淀粉的標志鏈帶藻（Desmodesmus insignis）在奶牛場廢水中的生長速度及油脂和淀粉的積累情況。中國海洋大學的呂素娟［40］研究了二形柵藻（Scenedesmus dimorphus）、綠擬球藻（Nannochloropsis sp.）及柵藻（Scenedesmus sp.）在城市生活廢水中的培養(yǎng)情況，進一步考察了在廢水中添加不同營養(yǎng)物質對高產油二形柵藻生長、生物量及油脂含量的影響。中國科學院廣州能源研究所的陸偉東等［41］利用奶牛場廢水培養(yǎng) Chlorella sp.進行廢水中N元素和P元素的去除及生物柴油的生產。ABREU等［42］利用奶酪乳清作為碳源對Chlorella vulgaris進行兼養(yǎng)培養(yǎng)，發(fā)現其生長速度比光自養(yǎng)條件下高，且在兼養(yǎng)條件下可獲得最高的淀粉產量。FAROOQ等［43］利用啤酒廠的廢水對兩株小球藻Chlorella sp. 進行兼養(yǎng)培養(yǎng)獲得了較高的油脂產量。

近期，人們對兼養(yǎng)可使用的微藻種類及碳源進行了更多的探索。DOS SANTOS等［44］對甘蔗渣水解液添加到 Spirulina maxima的生長培養(yǎng)基中利用的可行性進行了觀察，結果表明Spirulina maxima在自養(yǎng)（光照，培養(yǎng)基中沒有添加甘蔗渣水解液）、異養(yǎng)（黑暗，培養(yǎng)基中添加了甘蔗渣水解液）及兼養(yǎng)（光照，培養(yǎng)基中添加了甘蔗渣水解液）三種條件下均可以生長。MIRZAIE等［45］觀察了Chlorella vulgaris在自養(yǎng)、異養(yǎng)及兼養(yǎng)三種條件下的生長和油脂積累情況，實驗中分別使用廉價的廢糖蜜和玉米漿作為碳源和氮源。在兼養(yǎng)實驗中，獲得了最高的生物量 2.62 g/L和油脂產量0.86 g/L，分別比自養(yǎng)高140%和170%，分別比異養(yǎng)高300%和1 200%。WANG等［46］利用高COD含量和高氨基氮濃度的養(yǎng)豬場廢水來培養(yǎng)富含糖類的微藻Chlorella vulgaris JSC-6。結果表明在兼養(yǎng)和異養(yǎng)實驗中根據廢水的不同稀釋程度，60% ～70% 的COD和40% ～ 90%的氨基氮可被去除。用5倍稀釋的廢水進行兼養(yǎng)時，可以獲得最高生物量3.96 g/L，糖類含量高達58%。LIN等［47］觀察了微藻Chlorella sp. Y8-1在自養(yǎng)、異養(yǎng)（蔗糖作為碳源）及兼養(yǎng)三種條件下的油脂含量，發(fā)現 在兼養(yǎng)條件下油脂含量（35.5%）和油脂產量（0.01 g·L-1·d-1）均為最高。

綜上，由于微藻的兼養(yǎng)培養(yǎng)充分利用了自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)的優(yōu)點，因此多數情況下，兼養(yǎng)培養(yǎng)所獲得的生物量要高于自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)，表明對于可兼養(yǎng)的微藻而言，兼養(yǎng)是一種更有潛力的培養(yǎng)方式。

表1 三種不同培養(yǎng)方式的對比Table 1 Comparison of three different cultivation methods

4 微藻培養(yǎng)發(fā)展的限制因素及建議

自養(yǎng)培養(yǎng)發(fā)展的限制因素包括：（1）生物量過低，生物質能源產量的理論上限為38 000加侖·英畝·年，而由于藻株、油脂含量、光照及光合效率等諸多因素的限制，目前實際的藻類生物質能源產量上限約為4 350 ～ 5 700加侖·英畝·年，藻類油脂產量還有很大的提升空間［48］。（2） 跑道式開放塘難以保持純種培養(yǎng)。微藻的競爭者、捕食者和病原體非常多，目前對它們的了解卻很少［49-50］，在微藻大規(guī)模培養(yǎng)中這些生物會導致生物量下降、藻種不存及培養(yǎng)系統(tǒng)崩潰等嚴重問題。限制其他生物的污染的措施包括：建立快速、自動的生化檢測系統(tǒng)，對培養(yǎng)體系進行實時的連續(xù)監(jiān)測［51-52］；對生產藻種進行生理適應馴化和遺傳改造，使其生命力旺盛并具有較強的競爭力。

異養(yǎng)培養(yǎng)發(fā)展的限制因素包括：①可異養(yǎng)的微藻種類有限；②異養(yǎng)時的生物量還有待進一步提高；③外加碳源價格較高，增加了異養(yǎng)的生產成本。

針對以上限制因素，本文提出如下建議：

（1）利用基因工程育種結合細胞融合育種構建更高效的自養(yǎng)或異養(yǎng)微藻。（2）設計構造更加合理的生物反應器，提高生產效率。（3）研究代謝產物積累特點，結合數理統(tǒng)計方法設計優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高代謝產物產量。在光自養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的pH呈不斷上升趨勢，通過補加CO2不僅可以維持培養(yǎng)體系pH的相對穩(wěn)定，還可以增強光合作用所需CO2的供應，提高光合效率。（4）挖掘替代碳源。使用工業(yè)廢水、城市生活廢水、秸稈、甘蔗渣及淀粉等價格低廉的碳源來替代葡萄糖。（5）微藻的綜合利用。目前，微藻生物柴油的生產成本依然很高，限制了它的商業(yè)化生產。把生產微藻生物柴油和利用微藻開發(fā)高附加值產品相結合，實現微藻生物資源的綜合利用，才能有效降低生產成本，實現微藻生物柴油的商業(yè)化生產。潛在的高附加值產物包括：生物絮凝劑、類胡蘿卜素、黃酮、生物聚合物、多不飽和脂肪酸、活性多糖等［22，48，53］。此外，還可以通過吸收發(fā)電廠排放的CO2廢氣、處理農業(yè)和工業(yè)廢水、藻渣作為水產業(yè)的餌料等方式來降低生產成本。

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Research Progress on Cultivation Methods of Microalgae

SHANG Chang-hua1，2， ZHU Shun-ni2， WANG Zhong-ming2， YUAN Zhen-hong2， XIE Jun1
（1. Institute of New Energy and New Materials， South China Agricultural University； Key Laboratory of Energy Plant Resources and Utilization， Ministry of Agriculture， P. R. China； Key Laboratory of Biomass Energy of Guangdong Regular Higher Education Institutions，Guangzhou 510642， China； 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of New and Renewable Energy Research and Development， Key Laboratory of Renewable Energy， Guangzhou Institute of Energy Conversion， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510640， China）

Abstract：Microalgae is a promising feedstock for biodiesel production. Cultivation of microalgae is a key step in the process of producing biodiesel using microalgae as raw material. Research progress on cultivation methods of microalgae is discussed. Phototrophic cultivation， heterotrophic cultivation and mixotrophic cultivation are compared. Suggestions about cultivation of microalgae are proposed in this article.

Key words：microalgae； biodiesel； cultivation methods

中圖分類號：TK6

文獻標志碼：A

doi：10.3969/j.issn.2095-560X.2016.02.005

文章編號：2095-560X（2016）02-0105-06

* 收稿日期：2016-01-29

修訂日期：2016-03-15

基金項目：國家自然科學基金面上項目（51476177）；中國科學院可再生能源重點實驗室基金項目（y507j21001）

通信作者：?謝 君，E-mail：xiejun@scau.edu.cn

作者簡介：

尚?；ǎ?980-），男，碩士，助理研究員，主要從事微藻分子生物學研究。

謝 君（1965-），男，博士，教授，華南農業(yè)大學新能源與新材料研究所所長，主要從事能源植物及其生化轉化研究。