孫 圳，楊方威，李 俠，張春暉，謝小雷

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100193

ATR-FTIR分析凍結(jié)—解凍后的牛肉蛋白二級結(jié)構(gòu)變化

孫 圳，楊方威，李 俠，張春暉*，謝小雷

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100193

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜；牛肉；凍結(jié)—解凍；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

引 言

人類食用優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源之一即是畜禽魚肉等動物性蛋白質(zhì)。冷凍作為各類肉制品的主要保藏形式，在肉制品加工業(yè)中地位不可取代。在凍結(jié)—解凍過程中，會發(fā)生一系列對于肉質(zhì)產(chǎn)生影響的理化變化。尤其是肌肉蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及其與水分的互作關(guān)系[1]。對于肉類冷凍貯藏中國常用的溫度為-20～-40 ℃，但是凍結(jié)溫度對凍結(jié)—解凍過程中蛋白質(zhì)變性的影響機(jī)制尚不十分清楚。解凍后肉品品質(zhì)劣化及營養(yǎng)成分損失，也可能與凍結(jié)引起肌肉中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，目前對該方面的研究仍較少。

隨著光譜技術(shù)的發(fā)展，紅外光譜技術(shù)已成功地應(yīng)用于不同生物樣品的檢測、鑒別、鑒定和分類[2]。由于待測組分中原有的水分子或有機(jī)溶劑對于紅外光譜會產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收干擾，從而限制了FTIR的應(yīng)用。結(jié)合ATR技術(shù)與FTIR技術(shù)則可以有效解決上述難題。在紅外光穿透試樣表面并返回表面的過程中，試樣選擇吸收入射光，降低了反射光強(qiáng)度，由此產(chǎn)生的圖譜與透射吸收相類似，我們借助此去獲得樣品化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息[3-4]。ATR-FTIR光譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物大分子、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)監(jiān)測、生化反應(yīng)動力學(xué)等方面的研究[3]，其可測定溶液等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為為數(shù)不多的理解和表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的技術(shù)之一，尤其在測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中具有重要作用[5]。本研究以牛背最長肌(BoineLongissmusdorsi)作為研究對象，利用ATR-FTIR技術(shù)分析-18，-23及-38 ℃不同凍結(jié)溫度下牛肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)變化，探討凍結(jié)溫度對凍結(jié)—解凍過程中牛肉蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，以期為冷凍肉生產(chǎn)上凍結(jié)溫度和冷凍工藝的選擇進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

于北京御香苑畜牧有限公司購置400 kg的2歲齡草原黃牛背最長肌(BoineLongissmusdorsi)作為實(shí)驗(yàn)原料。屠宰后所獲胴體經(jīng)48 h冷風(fēng)吊掛排酸，隨后取12塊牛背最長肌，背最長肌來自于6頭情況相近的公牛(♂)胴體。肉塊大小約為5×4×4 cm，4 ℃冷藏運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室開始后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 主要設(shè)備與儀器

Vector 33傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)；BCDW-228冰箱、DW-86L386型Haier立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)；電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.3 樣品凍結(jié)與解凍

將牛肉樣平均隨機(jī)分成4組，3組用于凍結(jié)—解凍實(shí)驗(yàn)，分別置于-18，-23及-38 ℃下凍結(jié)。另一組置于4 ℃冷藏條件下進(jìn)行對照試驗(yàn)。利用TESTO溫度儀記錄肉樣幾何中心溫度變化，記錄間隔為1 min。當(dāng)樣品中心溫度達(dá)到預(yù)期凍結(jié)溫度后，取出肉樣，停止凍結(jié)，于4 ℃條件下解凍至中心溫度達(dá)環(huán)境溫度，停止解凍過程。

1.4 指標(biāo)測定與數(shù)據(jù)分析

1.4.1 肌原纖維蛋白提取

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)主要由肌球蛋白和肌動蛋白組成，是組成肌肉中肌原纖維的蛋白質(zhì)。解凍前后牛肉樣品處理相同。采用ATR-FTIR分析凍結(jié)、解凍前后牛肉MP的二級結(jié)構(gòu)變化。參照李銀等[6]的方法，從牛背最長肌中分離提取MP： 去除肉樣的可見脂肪和結(jié)締組織，隨后將肉樣切碎放入預(yù)冷的燒杯中稱重；向燒杯中加入4倍體積(V/W)的分離緩沖液(0.1 mol·L-1NaCl，10 mmol·L-1磷酸三鈉，2 mmol·L-1MgCl2，l mmol·L-1EGTA，pH 7.0)，于組織搗碎機(jī)中充分?jǐn)匕杌靹?，得到均勻的肉糜混合液；形成的肉漿離心(2 000 g，15 min，4 ℃)，取其沉淀；在相同條件再洗滌、繼續(xù)離心兩次，用紗布過濾除去肌膜及脂肪組織等；隨后用4倍體積(V/W)的0.1 mol·L-1NaCl溶液洗滌、離心兩次(2 000 g，15 min，4 ℃)，得到MP

分離物在碎冰中保存。再根據(jù)Chelh等[7]的方法，將MP分離物用20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值6.0)調(diào)制成濃度為2 mg·mL-1的溶液。

1.4.2 牛肉蛋白質(zhì)ATR-FTIR光譜測定

根據(jù)Gangidi等[8]的方法，取適量上述MP溶液置于ATR附件上掃描，同時(shí)使用OMNIC軟件記錄紅外譜圖，通過扣除水背景進(jìn)行基線校準(zhǔn)，掃描范圍為4 000～400 cm-1，掃描100次，掃描的分辨率為4 cm-1。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用PeakFit 4.12軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)對所得牛肉紅外光譜進(jìn)行解譜，并利用Microsoft Excel 2013軟件對試驗(yàn)結(jié)果繪圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度凍結(jié)—解凍后牛肉MP的ATR-FTIR光譜特征

圖1 牛肉肌原纖維蛋白ATR-FTIR圖譜

Note： Letter-numbers “F-n” in the figure express that the beef was frozen at -n℃, and letter-numbers “T-n” in the figure express that frozen beef at -n℃ was thawed to 4 ℃, the same below

2.2 不同溫度凍結(jié)—解凍后牛肉MP的ATR-FTIR光譜酰胺Ⅰ帶變化及曲線擬合分析

由圖2可知，不同溫度貯藏牛肉MP的酰胺Ⅰ帶變化明顯。由圖3可知，牛肉MP紅外光譜曲線擬合后的酰胺Ⅰ帶圖譜有13個(gè)與結(jié)構(gòu)相關(guān)的峰(其中有4個(gè)較弱的峰、9個(gè)強(qiáng)峰)，表明牛肉MP的二級結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。新鮮牛肉在凍結(jié)后紅外光譜圖會發(fā)生變化。凍結(jié)后肉樣與新鮮肉樣相比較，肉樣光譜圖峰面積減小同時(shí)峰高降低。然而解凍后的牛肉肉樣光譜圖峰面積增大，峰高升高。且伴隨著凍結(jié)—解凍過程，肉樣光譜圖出峰出現(xiàn)“紅移”或者“藍(lán)移”，這說明凍結(jié)—解凍過程會增強(qiáng)或降低牛肉MP肽鏈的分子間作用。這一結(jié)果表明牛肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在凍結(jié)過程中遭到了破壞，蛋白聚集體的高級結(jié)構(gòu)在低溫凍結(jié)作用下展開；與之對應(yīng)，解凍后的牛肉由于凍結(jié)展開的變性蛋白，在解凍過程中重新聚合，一定程度上發(fā)生復(fù)性。

圖2 牛肉肌原纖維蛋白酰胺Ⅰ帶去卷積ATR-FTIR圖譜

2.3 不同溫度凍結(jié)—解凍后牛肉MP二級結(jié)構(gòu)變化

對譜圖中酰胺Ⅰ帶利用二階求導(dǎo)去卷積技術(shù)進(jìn)行分峰處理。并對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)通過曲線擬合的方法進(jìn)行定量分析。圖4為不同溫度凍結(jié)—解凍后牛肉MP的二級結(jié)構(gòu)相對含量。由圖4可知，在凍結(jié)作用的影響下，肉樣肌原纖維蛋白中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量降低，相應(yīng)的無規(guī)則卷曲比例增高；并且貯藏溫度越低α-螺旋比例下降趨勢越緩慢，從圖4中可以發(fā)現(xiàn)，4 ℃鮮肉中α-螺旋比例甚至低于-38 ℃凍結(jié)后肉樣。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分有序結(jié)構(gòu)和無序結(jié)構(gòu)，有序結(jié)構(gòu)的代表有α-螺旋、β-折疊，二者含量的減少表明凍結(jié)過程中冰晶的形成會影響蛋白原有二級結(jié)構(gòu)。氫鍵等維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力因冰晶形成而被破壞，有序結(jié)構(gòu)減少。即蛋白質(zhì)α-螺旋等有序結(jié)構(gòu)由于凍藏向無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變。羰基和氨基之間的氫鍵是維持α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力，α-螺旋的減少表明牛肉蛋白MP分子中原本在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)表面疏水性增大。

圖3 牛肉肌原纖維蛋白去卷積擬合后ATR-FTIR酰胺Ⅰ帶圖譜

圖4 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量變化

Note： Letter-numbers “F-n” in the table express that the beef was frozen at -n℃, and letter-numbers “T-n” in the table express that frozen beef at -n℃ was thawed to 4 ℃

對于解凍后牛肉肌原纖維蛋白溶液檢測發(fā)現(xiàn)，和凍結(jié)牛肉相比，肉樣蛋白中α-螺旋，β-折疊含量增加，而無序結(jié)構(gòu)代表(無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角)含量降低。由此可以看出，解凍后肌原纖維蛋白穩(wěn)定性增加，由于凍結(jié)導(dǎo)致的蛋白變性發(fā)生復(fù)性。解凍過程中蛋白質(zhì)復(fù)性，肽鏈發(fā)生聚合，推測低溫凍結(jié)會促進(jìn)牛肉MP蛋白的復(fù)性。β-轉(zhuǎn)角是由多肽鏈反轉(zhuǎn)180°形成，由于外加凍結(jié)—解凍的過程，原有肽鏈的結(jié)構(gòu)被牛肉肉樣中水分的不斷遷移所改變，因此β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)難以被維持。并且α-螺旋結(jié)構(gòu)在空間位阻上要比β-轉(zhuǎn)角大。所以相比于α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基更容易受凍結(jié)、解凍的影響，牛肉β-轉(zhuǎn)角含量由于經(jīng)過凍結(jié)—解凍過程出現(xiàn)較大幅度下降。三個(gè)凍結(jié)溫度相比，-38 ℃下凍結(jié)后解凍的肉樣，其β-折疊增加量要高于-23和-18 ℃溫度下凍結(jié)后解凍肉樣。以上試驗(yàn)結(jié)果說明，-38 ℃凍結(jié)能夠更加有效的保持牛肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，維持牛肉品質(zhì)。

3 結(jié) 論

牛肉凍結(jié)—解凍過程中會發(fā)生一系列復(fù)雜的變化，牛肉蛋白質(zhì)也會發(fā)生變性與復(fù)性。凍結(jié)會造成牛肉蛋白二級結(jié)構(gòu)破壞和高級結(jié)構(gòu)展開，導(dǎo)致牛肉蛋白變性；解凍后，變性展開的蛋白質(zhì)又會重新聚集，發(fā)生蛋白質(zhì)復(fù)性；凍結(jié)會對牛肉蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)造成影響，導(dǎo)致原有結(jié)構(gòu)中穩(wěn)定的有序結(jié)構(gòu)(α-螺旋，β-折疊等)向無序結(jié)構(gòu)(無規(guī)則卷曲等)轉(zhuǎn)變，解凍后其α-螺旋、β-折疊含量又會升高；-38 ℃凍結(jié)牛肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性最好，解凍后蛋白質(zhì)復(fù)性也最好。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變性情況與凍結(jié)溫度密切相關(guān)，研究中發(fā)現(xiàn)，隨著凍結(jié)溫度降低，牛肉蛋白質(zhì)冷凍變性程度越低，復(fù)性程度越好，且蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)保持的越完整?？梢?，利用ATR-FTIR技術(shù)能夠反映牛肉凍結(jié)—解凍過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化情況，揭示牛肉蛋白質(zhì)的變性規(guī)律，進(jìn)而可以鑒別、評價(jià)冷凍肉的品質(zhì)。

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*Corresponding author

(Received Nov. 19, 2015; accepted Mar. 5, 2016)

Effects of Freezing and Thawing Treatments on Beef Protein Secondary Structure Analyzed with ATR-FTIR

SUN Zhen，YANG Fang-wei，LI Xia，ZHANG Chun-hui*，XIE Xiao-lei

Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Comprehensive Key Laboratory of Agro-Products Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100193，China

Attenuated total reflectance Fourier transfer infrared spectroscopy；Beef；Freezing-thawing；Protein secondary structure

2015-11-19，

2016-03-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301511)資助

孫 圳，1993年生，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所碩士研究生 e-mail： tinyass@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail： dr_zch@163.com

O657.3

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10.3964/j.issn.1000-0593(2016)11-3542-05