吳志豪，　李香利，　鄭　敏

(溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院乳腺外科，浙江 溫州 325000)

百里醌抑制乳腺癌血管生長的實驗研究*

吳志豪△，李香利，鄭敏

(溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院乳腺外科，浙江 溫州 325000)

[摘要]目的： 探討百里醌對乳腺癌血管生長的作用于及其機制。方法: 不同濃度百里醌作用于人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)及人乳腺癌細胞株MCF-7后，應用CCK-8法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡，小管形成實驗檢測內皮細胞體外小管形成能力，Western blot法檢測內皮細胞中cleaved caspase-3、p-ERK及p-AKT的蛋白水平；建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型，完全隨機法分成對照組和百里醌組，免疫組織化學法檢測乳腺腫瘤組織中CD31的表達，TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡。結果: 百里醌(20～80 nmol/L)對MCF-7細胞生長無明顯抑制作用，20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L百里醌作用于內皮細胞24 h后，細胞存活率分別為(74.3±5.9)%、(68.7±5.6)%和(47.9±4.3)%；20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L百里醌作用于MCF-7細胞24 h后，細胞凋亡率分別為(2.6±0.3)%、(2.4±0.3)%和(4.6±0.4)%，而相應的內皮細胞凋亡率分別為(21.5±3.7)%、(23.8±2.9)%和(27.8±3.1)%，內皮細胞較乳腺癌細胞對百里醌反應更敏感(P<0.05)；20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L百里醌作用于內皮細胞1 h后，內皮細胞小管形成長度分別為(0.88±0.12)mm、(0.76±0.10)mm和(0.54±0.08)mm，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；80 nmol/L百里醌作用于內皮細胞24 h后，內皮細胞中cleaved caspase-3的水平上調， AKT和ERK磷酸化被抑制，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；免疫組化檢測移植瘤組織中CD31結果顯示，百里醌組IA值明顯少于對照組(P<0.05)；TUNEL檢測結果顯示，百里醌組IA值明顯增大(P<0.05)。結論: 百里醌可抑制體內外乳腺癌血管生長，降低p-ERK及p-AKT的水平可能是其作用機制之一。

[關鍵詞]乳腺腫瘤； 百里醌； 內皮細胞； 腫瘤血管生成

腫瘤血管生成與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，血管生成在腫瘤的起始到轉移的過程中均起重要作用[1]。新生血管形成是由一系列步驟組成的生物學過程，包括內皮細胞增殖和遷移、血管管腔的形成與存活[2-3]。以腫瘤內皮細胞為靶點的抗血管生成治療，具有高效、低毒及不易耐藥等優(yōu)點。

百里醌(thymoquinone, TQ)是一種生長于地中海和印度邊界地帶的草本植物-黑種草籽中提取出來的具有生物活性的成份，已有大量動物實驗研究表明它的抗癌效果顯著，目前已將其用于臨床Ⅰ期試驗[4-6]。但目前尚未有百里醌對腫瘤血管生長作用的系統(tǒng)性研究報道，因此，本研究將探討低劑量百里醌對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)活力及體外小管生成的影響以及對人乳腺癌血管生長的影響及其可能機制。

材料和方法

1實驗動物、主要藥品和試劑

4～6周齡雌性BALB/c-nu/nu品系裸小鼠，無特定病原體級，體重(18.56±0.85) g，購自中科院上海動物實驗中心，動物質量合格證號SCXK(滬)2007-0005。均在溫州醫(yī)學院動物實驗中無特殊病原菌條件下分籠飼養(yǎng)。

百里醌購自Sigma；胎牛血清(fetal bovine se-rum，FBS)、含EDTA胰酶和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；CCK-8細胞活性檢測試劑盒購自Dojindo；人工基底膜購自BD；Ki-67和CD31多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；ABC免疫組化檢測試劑盒和AEC染色試劑盒購自華美生物工程公司；cleaved caspase-3、磷酸化的細胞外信號調節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)、p-AKT和β-actin抗體購自Epitomics；TUNEL試劑盒購自深圳晶美生物技術有限公司。百里醌用無水乙醇配制成10 mmol/L，-20 ℃保存，用時用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

2細胞分組及藥物干預

人臍靜脈內皮細胞和人乳腺癌細胞株MCF-7均購自ATCC，細胞生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，含1%的青-鏈霉素，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內孵育，胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞為實驗對象。實驗分組如下：對照組(1%乙醇)和百里醌低、中、高劑量(20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L)組，將上述細胞培養(yǎng)24 h后，再加入不同劑量百里醌作用，測定各項實驗指標。

3實驗方法

3.1細胞活力檢測各組細胞經百里醌作用24 h后以0.05 %胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，調整細胞濃度為5×108/L，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔10 μL。同時設置空白調零組(不加細胞加入等量的無水乙醇)，以及陰性對照組(加細胞加入等量的無水乙醇)。分組培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃孵育4 h，酶標儀450 nm下讀取吸光度(A)值。細胞存活率(%)=(實驗組A450值-空白調零組A450值)/(對照組A450值-空白調零組A450值)×100%。

3.2流式細胞術檢測細胞凋亡將百里醌作用24 h后的細胞用胰酶消化，冷PBS洗滌2次后重懸并計數，1 000 r/min離心5 min，用500 μL binding buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻后室溫避光反應20 min，隨即用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

3.3小管形成實驗小管形成實驗參照Yi等[7]的方法，4 ℃下在24孔板內用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基及人工基底膜制備底層凝膠，鋪平后置37 ℃培養(yǎng)箱內固定5 h。收集不同濃度百里醌作用1 h后的HUVECs，重懸后以每孔4×104個細胞接種于底層凝膠上，每組設5個復孔，24 h后在倒置顯微鏡下觀察小管形成情況，以顯微鏡下能觀察到完整連續(xù)的管狀結構為小管形成判定標準，隨機選取5個視野，應用ImageJ軟件計算有效管腔結構的平均長度，并統(tǒng)計分析。

3.4Western blot檢測蛋白的表達胰酶消化各組處理24 h后的細胞，經PBS洗滌后加入RIPA裂解液裂解細胞，提取上清液。用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品(每孔20 μg)，常規(guī)8% SDS-PAGE，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入 I 抗(1∶1 000)于4 ℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為 II 抗(1∶2 500)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光，條帶曝光強度用Quantity One 4.6.2(Bio-Rad)軟件分析，以β-actin為內參照，通過與內參照的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

3.5裸鼠乳腺癌移植瘤模型制備及分組參照劉岸等[8]的方法制備裸鼠移植瘤模型，共制備20只裸鼠，移植術后第3周將實驗動物按完全隨機法分成對照組和百里醌組，每組10只。手術后第3周開始給藥，每周經灌胃給藥3次，共2周。對照組給予溶媒(1%乙醇)每只0.2 mL；百里醌組給予百里醌10 mg/kg體重。術后第8周處死裸鼠，尸檢裸鼠證實乳腺移植瘤成瘤率為100%，完整切除乳腺腫瘤組織后置4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，進行連續(xù)切片，烘干備用。

3.6免疫組織化學法檢測裸鼠乳腺腫瘤組織中CD31的表達按照EnVision法的操作步驟進行免疫組化實驗，每組選取5個標本經正常羊血清封閉非特異性抗原，加入 I 抗孵育過夜后，加入生物素標記的 II 抗，DAB顯色，蘇木精復染，脫水后封片。低倍鏡(×100)下隨機選擇20個視野，圖片結果用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件進行分析。

3.7 TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡按TUNEL試劑盒說明書操作，在顯微鏡下觀察，凋亡細胞判定標準為細胞核發(fā)生固縮、染色體凝集成塊或邊集、呈棕褐色染色，低倍鏡(×100)下隨機選擇20個視野，圖片結果用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件進行檢測積分吸光度(integral absorbance，IA)值。

4統(tǒng)計學處理

實驗所得計量數據均以均數±標準差(mean±SD)的形式表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及SNK-q法進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1百里醌對體外人臍靜脈內皮細胞和人乳腺癌細胞株MCF-7活力的影響

百里醌(80 nmol/L)作用于MCF-7細胞24 h、48 h和72 h后，細胞存活率分別為(97.2±6.2)%、(95.7±7.7)%和(93.8±7.3)%，與對照組相比較，均無統(tǒng)計學差異；而不同濃度百里醌(20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L)作用于內皮細胞24 h后，細胞存活率分別為(74.3±5.9)%、(68.7±5.6)%和(47.9±4.3)%；作用48 h后，細胞存活率分別為(66.1±8.3)%、(53.7±3.4)%和(41.6±4.9)%；作用72 h后，細胞存活率分別為(54.4±4.6)%、(42.8±3.9)%和(38.7±4.1)%，與陰性對照組相比均有顯著差異(P<0.05)，呈明顯劑量依賴性和時間依賴性，見圖1。

Figure 1.HUVECs were treated with different concentrations of thymoquinone (TQ) for 24 h, 48 h and 72 h and analyzed for viable cells by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1不同濃度百里醌對人臍靜脈內皮細胞存活率的影響

2百里醌對體外人臍靜脈內皮細胞和人乳腺癌細胞株MCF-7凋亡的影響

流式細胞術結果表明，百里醌(20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L)作用MCF-7細胞24 h后，僅百里醌濃度為80 nmol/L時才對乳腺癌細胞凋亡有明顯影響(P<0.05)；不同濃度百里醌作用于內皮細胞24 h后，細胞凋亡率均顯著高于MCF-7細胞(P<0.05)，見圖2。

3百里醌對內皮細胞體外小管生成的影響

如圖3所示，百里醌短時間(1 h)作用于內皮細胞不僅可減少內皮細胞體外小管形成數量，而且影響內皮細胞管腔連續(xù)性，百里醌(20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L)作用于內皮細胞1 h后，內皮細胞小管形成長度分別為(0.88±0.12) mm、(0.76±0.10) mm和(0.54±0.08) mm，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。為排除百里醌抑制內皮細胞小管形成作用是由于百里醌的增殖抑制作用，本研究預實驗表明，百里醌(80 nmol/L)作用于內皮細胞1 h對內皮細胞生長無明顯影響。

4百里醌對內皮細胞中蛋白表達的影響

不同濃度百里醌作用內皮細胞24 h后cleaved caspase-3的蛋白水平隨著百里醌濃度的增加而上調；而百里醌可呈濃度依賴性抑制HUVECs中AKT和ERK的磷酸化水平，與對照組相比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，見圖4。

Figure 2.The effects of thymoquinone (TQ) on the apoptosis of MCF-7 cells and HUVECs detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCF-7.

圖2流式細胞術檢測百里醌對人臍靜脈內皮細胞和人乳腺癌細胞株MCF-7凋亡的影響

Figure 3.Thymoquinone (TQ) inhibited the tube formation of HUVECs (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3顯微鏡下觀察內皮細胞小管形成

Figure 4.The effects of thymoquinone (TQ) on the protein levels of cleaved caspase-3, p-ERK and p-AKT in the HUVECs detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4Western blot檢測百里醌對內皮細胞中cleaved caspase-3、p-AKT和p-ERK蛋白水平的影響

5百里醌對裸鼠乳腺腫瘤組織中CD31的表達以及對細胞凋亡的影響

如圖5所示，CD31陽性細胞表現呈胞膜為棕褐色；TUNEL染色陽性細胞表現為胞核呈棕褐色。免疫組化圖片經過Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件分析后，用IA表示染色陽性細胞的比例。與對照組相比較，百里醌組裸鼠腫瘤組織中CD31的陽性表達強度明顯低于對照組，而百里醌組TUNEL陽性細胞明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Figure 5.Histology of the MCF-7 xenograft tumors upon staining with CD31 and TUNEL (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5免疫組化檢測裸鼠腫瘤組織中CD31的表達和TUNEL檢測細胞凋亡

討論

新生血管形成即內皮細胞增殖并重新排列成新的血管的過程，抑制內皮細胞增殖并抑制其管腔形成可明顯抑制腫瘤生長和轉移，從而成為一種新的治療惡性腫瘤的手段[9]。本課題組前期研究發(fā)現，百里醌對內皮祖細胞體外小管形成有一定抑制作用，同時百里醌對乳腺癌有一定抑制作用，并推測內皮細胞可能在百里醌抑制乳腺癌生長中發(fā)揮了一定作用，但作用機制尚不明確，為此本課題進一步探討內皮細胞在百里醌調控乳腺癌血管生長中的作用。體外實驗結果表明，百里醌可有效抑制體外內皮細胞增殖和小管形成，同時促進內皮細胞凋亡，顯示出百里醌具有一定的抑制體外血管生成的作用，與文獻報道相仿[5]。為了證實百里醌抑制惡性腫瘤生長是否主要通過抑制新生血管形成而實現，我們檢測了相同濃度的百里醌對人臍靜脈內皮細胞和乳腺癌細胞的作用效果，細胞活力和凋亡實驗結果表明，內皮細胞10倍敏感于乳腺癌細胞對于百里醌的生長抑制和凋亡誘導作用。另外對體外內皮細胞中cleaved caspase-3的蛋白水平進行分析結果表明，百里醌可濃度依賴性促進內皮細胞中cleaved caspase-3的水平，從而首次表明百里醌可在較低濃度時抑制體外人臍靜脈內皮細胞生長，增加cleaved caspase-3的水平可能是其抑制內皮細胞生長的作用機制之一。

在體內實驗中，筆者建立起裸鼠乳腺癌皮下移植瘤模型，并使用相對低劑量(10 mg/kg體重)百里醌作用荷瘤裸鼠，實驗表明百里醌可誘導腫瘤組織細胞凋亡；另外在百里醌給藥期間，裸鼠無一例出現明顯毒副反應，表明低劑量百里醌在對機體無明顯影響的前提下可誘導腫瘤細胞凋亡，與文獻報道相仿[7]。CD31作為黏附分子免疫球蛋白超家族的主要成員，可黏附于腫瘤細胞和血管內皮細胞上，從而在惡性腫瘤的新生血管形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[10]。在本研究中，對CD31進行免疫組化實驗結果表明百里醌作用后裸鼠腫瘤組織中血管生成數量明顯減少，從而表明抑制血管生長在百里醌抑制乳腺癌移植瘤生長中發(fā)揮了一定的作用，證實低劑量百里醌作為一種血管生成抑制劑的有效性和安全性。

當前已經證實通過抑制腫瘤血管生長可抑制腫瘤生長和轉移，從而改善病人預后[11]，而當前發(fā)現的血管抑制劑如COX-2抑制劑塞來昔布可引起粒細胞減少和貧血等毒副作用[12]。同時乳腺癌作為一種高度惡性腫瘤，治療效果差，化療藥物劑量越小對患者的毒副作用越小，本研究體外實驗表明臍靜脈內皮細胞更敏感于乳腺癌細胞對百里醌的細胞毒作用，同時體內實驗進一步表明低劑量百里醌作用裸鼠后對裸鼠無明顯毒副作用，從而為臨床應用極低劑量百里醌治療乳腺癌奠定了一定理論基礎。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在調控內皮細胞一系列重要功能諸如遷移、生長、增殖、凋亡以及新陳代謝中發(fā)揮了重要調控作用；同時AKT可調控內皮型一氧化氮合酶活性，從而刺激血管舒張、血管重塑以及新生血管形成[13]；另外，AKT還可刺激血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和其它重要血管調控因子的分泌[14]；同時活化的ERK可調控NF-κB和c-Jun等底物從而進一步調控血管生長[15]；而ERK也同時為內皮型一氧化氮合酶激活所必須[16]。在本研究中，Western blot實驗表明AKT和ERK在人臍靜脈內皮細胞中磷酸化程度較高，而低劑量百里醌可部分抑制體外內皮細胞中p-AKT和p-ERK的水平，同時百里醌還能有效抑制內皮細胞增殖和小管形成，從而首次表明百里醌可能通過抑制AKT和ERK的激活從而抑制乳腺腫瘤中血管生成。

總之，本次實驗系統(tǒng)性表明低劑量百里醌可明顯抑制人臍靜脈內皮細胞生長和小管形成，同時低劑量百里醌還可抑制體內乳腺癌血管生成，而百里醌抑制AKT/ERK信號通路可能是其抗血管生成效應的作用機制之一，展示了百里醌作為一種低毒高效的抗血管生長抑制劑的廣闊前景。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Anti-angiogenic effect of thymoquinone on breast cancer

WU Zhi-hao, LI Xiang-li, ZHENG Min

(DepartmentofBreastSurgery,SecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:hosrml@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the anti-angiogenic effect of thymoquinone on human breast cancer and the possible mechanism. METHODS: The activities of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and human breast cancer MCF-7 cells were assessed by CCK-8 assay. The apoptotic rate was measured by flow cytometry. Furthermore, the assay of capillary tube formation was used to observe the effect of thymoquinone on the tube formation of HUVECs. The protein levels of cleaved caspase-3, p-ERK and p-AKT were detected by Western blot. MCF-7 cells were subcutaneously injected into nude mice to establish breast xenograft tumors. After 3 weeks of implantation, the mice were randomized into control group and thymoquinone group. After the mice were sacrificed, immunohistochemistry was used to detect the expression of CD31 in the tumors, and the TUNEL test kit was used to explore cell apoptosis in the tumor tissues. RESULTS: Thymoquinone at concentrations of 20～80 nmol/L exerted no growth inhibitiory effect on MCF-7 cells. However, the cell viability of HUVECs were (66.1±8.3)%, (53.7±3.4)% and (41.6±4.9)% when the concentrations of thymoquinone were 20, 40 and 80 nmol/L, respectively. The apoptotic ratio of MCF-7 cells were (2.6±0.3)%, (2.4±0.3)% and (4.6±0.4)% and the apoptotic ratio of HUVECs were (21.5±3.7)%, (23.8±2.9)% and (27.8±3.1)% when the concentrations of thymoquinone were 20, 40 and 80 nmol/L, respectively. HUVECs were more sensitive to thymoquinone-induced apoptosis and inhibition in the cell activity than MCF-7 cells. Incubation of HUVECs with diffe-rent concentrations of thymoquinone (20, 40 and 80 nmol/L) for 1 h decreased their tube formation capacity (P<0.05). The protein level of cleaved caspase-3 was up-regulated, but the phosphorylation of AKT and ERK were inhibited in a concentration-dependent manner. The immunohistochemical analysis of CD31 showed significant difference of the integral absorbance between control group and thymoquinone group, and the TUNEL-positive cells in thymoquinone group was significantly more than that in control group. CONCLUSION: Thymoquinone has the anti-angiogenic effect on breast cancer both in vitro and in vivo, which may be related to the decreases in p-ERK and p-AKT.

[KEY WORDS]Breast neoplasms; Thymoquinone; Endothelial cells; Tumor angiogenesis

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0106- 06

[收稿日期]2015- 06- 23[修回日期] 2015- 10- 12

*[基金項目]溫州市科技計劃(No. Y20130278)

通訊作者△Tel: 0577-88002616； E-mail： hosrml@qq.com

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.018