文艷飛，　蔡柳洪△，　何　文，　曾敏慧，　蔣滿波

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心, 廣東 廣州 510630;2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心, 廣東 廣州 510120； 3廣東省中醫(yī)院生殖科，廣東 廣州 510006)

卵巢早衰患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建系、鑒定及誘導(dǎo)分化*

文艷飛1，蔡柳洪1△，何文1，曾敏慧2，蔣滿波3

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心, 廣東 廣州 510630;2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心, 廣東 廣州 510120；3廣東省中醫(yī)院生殖科，廣東 廣州 510006)

[摘要]目的： 建立和鑒定卵巢早衰(又稱原發(fā)性卵巢功能不全，primary ovarian insufficiency，POI)患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，研究其向原始生殖細(xì)胞分化的潛能。方法: 將表達(dá)Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4和Lin28基因的pEB-C5和表達(dá)SV40 T抗原的pEB-Tg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染POI患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，將其重編程為iPSCs并檢測其干細(xì)胞多能性特性。添加轉(zhuǎn)化生長因子β1(transfroming growth factor-β1，TGF-β1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)后，應(yīng)用real-time PCR和 Western blot方法分別檢測原始生殖細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: 通過堿性磷酸酶染色、細(xì)胞免疫熒光、擬胚體及畸胎瘤形成檢測，證明了POI患者外周血來源的iPSCs可成功向3胚層細(xì)胞分化并保持多能性。添加TGF-β1和BMP4后，誘導(dǎo)組原始生殖細(xì)胞特異性標(biāo)志物干細(xì)胞生長因子受體(stem cell growth factor receptor, c-Kit)、發(fā)育多能性相關(guān)蛋白 3 (developmental pluripotency-associated 3，STELLA/DPPA3)和DEAD盒多肽 4(DEAD box polypeptide 4，VASA/DDX4)的mRNA水平明顯升高(P<0.05)，VASA/DDX4蛋白表達(dá)水平亦明顯增加(P<0.05)。結(jié)論: POI患者外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外可被成功誘導(dǎo)成無外源性基因整合的iPSCs，并且具有多能分化特性，添加TGF-β1和BMP4后可向原始生殖細(xì)胞分化。

[關(guān)鍵詞]原發(fā)性卵巢功能不全； 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞； 原始生殖細(xì)胞

卵巢早衰(premature ovarian failure;又稱原發(fā)性卵巢功能不全, primary ovarian insufficiency，POI)是指育齡女性40歲以前出現(xiàn)卵巢功能減退，表現(xiàn)閉經(jīng)、高促性腺激素和低雌激素狀態(tài)[1]，是女性不孕的常見原因。其診斷標(biāo)準(zhǔn)為40歲之前出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)至少4個(gè)月、血清卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平至少2次大于40 IU/L(2次檢查時(shí)間間隔至少1個(gè)月)和低雌激素水平[2]。卵巢早衰的發(fā)病率大約為1%[3]，近年來呈上升趨勢。卵巢早衰的病因復(fù)雜，可能與遺傳、免疫、環(huán)境和醫(yī)源性因素相關(guān)[4]。目前常見的激素替代治療無法解決患者的生育要求。而贈(zèng)卵胚胎移植、卵巢或卵母細(xì)胞移植技術(shù)則面臨倫理困境和來源匱乏的問題。2007年Takahashi 等[5]首次通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將人成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，開創(chuàng)了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞建系的先河，為患者特異性的iPSCs建系奠定了基礎(chǔ)。iPSCs具有干細(xì)胞的多能性分化特點(diǎn)，可以向任何一種體細(xì)胞包括向原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)分化[6-7]，這可能是治療POI的方向之一。將iPSCs向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法多樣，比如添加細(xì)胞因子Wnt3a、forskolin、維甲酸、內(nèi)皮生長因子[8-9]，或者與基質(zhì)細(xì)胞(如卵巢顆粒細(xì)胞、卵巢成纖維細(xì)胞)共培養(yǎng)[10-11]，或者添加卵泡液[12]等，但目前尚無被廣泛接受的生殖細(xì)胞誘導(dǎo)方案，也無應(yīng)用POI患者特異的iPSCs細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化的報(bào)道。本研究在采用POI外周血細(xì)胞建立iPSCs的基礎(chǔ)上，以細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)為誘導(dǎo)劑，檢測其是否能向原始生殖細(xì)胞分化，為POI患者特異iPSCs可能的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料和方法

1材料

Essential 8TM培養(yǎng)基、Matrigel、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、KnockoutTMDMEM高糖培養(yǎng)基、KnockoutTM血清替代物(KnockoutTMserum replacement，KSR)、青/鏈霉素、L-谷氨肽胺(GlutaMAXTM-I)、非必需氨基酸(nonessential amino acids, NEAA)、β-巰基乙醇、0.05%胰酶-EDTA、淋巴細(xì)胞分離液、胰島素轉(zhuǎn)硒乙醇胺和real-time PCR試劑盒均購于Invitrogen；牛血清蛋白、絲裂霉素C和秋水仙堿均購自Sigma；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)購自PeproTech；電轉(zhuǎn)試劑盒(Lonza);質(zhì)粒大量提取試劑盒(Qiagen)；Triton X-100、Tris-HCl和Tween-20(Amresco)；4%多聚甲醛和正常山羊血清封閉液(BOSTER)；Hoechst 33342(碧云天)；Oct4抗體、Sox2抗體、Tra-1-60抗體、Nannog抗體和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)染色試劑盒(Sidansai)；ROCK inhibitor(Selleck)；質(zhì)粒pEB-C5和pEB-Tg由美國Johns Hopkins大學(xué)Linzhao Cheng Lab惠贈(zèng)；總RNA提取試劑盒購自O(shè)mega；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；VASA單克隆抗體購自Abcam；辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自KeyGEN；所有引物購自廣州鉑萊公司，具體序列見表1。

表1　引物序列

外周血30 mL取自同一例POI患者，告知患者實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟⒑炇鹬橥鈺?3.5 d昆明孕鼠由中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。項(xiàng)目的實(shí)施獲得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2方法

2.1外周血單個(gè)核細(xì)胞分離及培養(yǎng)和核轉(zhuǎn)染按照課題組之前已經(jīng)建立的方法[13]進(jìn)行。簡單說來，以孕13.5 d昆明小鼠胚胎皮膚制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代時(shí)用10 mg/L的絲裂霉素37 ℃處理3 h，吸棄培養(yǎng)液，0.05%胰酶+EDTA消化后離心，鋪12孔板(每孔2×105)備用。以Ficoll Paque Plus分離POI外周血單個(gè)核細(xì)胞，體外培養(yǎng)8 d后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)為2×106，利用Lonza試劑盒，電轉(zhuǎn)緩沖液100 μL中加入8 μg pEB-C5和4 μg pEB-Tg，選擇Nucleofector II的T-016程序，轉(zhuǎn)染后第12～14天觀察iPSCs克隆形成。

2.2G顯帶核型分析和iPSCs多能性鑒定G顯帶核型分析、iPSCs AKP染色和表面標(biāo)志物免疫熒光檢測(Oct4、Sox2、Nanog、Tra-1-60)，以及iPSCs體內(nèi)分化能力鑒定(畸胎瘤形成)和體外分化能力鑒定(體外擬胚體形成)根據(jù)課題組之前建立的方法進(jìn)行[13]。

2.3 iPSCs向原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化將細(xì)胞分為對照組和誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組用去bFGF的iPSCs培養(yǎng)液添加1 μg/L TGF-β1預(yù)誘導(dǎo)2 d，第3天添加50 μg/L BMP4培養(yǎng)5 d，對照組不添加上述細(xì)胞因子，每2 d更換1次培養(yǎng)基。誘導(dǎo)7 d后分別收集2組細(xì)胞總RNA和蛋白。

2.4Real-time PCR檢測原始生殖細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)總RNA提取試劑盒收集誘導(dǎo)組和對照組細(xì)胞的RNA，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，采用SYBR Green RT-PCR試劑盒，在PCR儀(ABI 7500)上進(jìn)行3步法擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。表達(dá)水平以2-ΔΔCt值表示，計(jì)算Oct4、c-Kit、STELLA和VASA與內(nèi)參照β-actin的比值。

2.5Western blot檢測原始生殖細(xì)胞標(biāo)志蛋白VASA的表達(dá)用含PMSF的裂解液裂解2組蛋白，酶標(biāo)儀測定蛋白濃度，以每孔20 μL上樣，進(jìn)行SDS-PAGE，然后將凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5% BSA的TBST 37 ℃封閉1 h。加I抗VASA兔單克隆抗體(1∶1 000)，內(nèi)參照I 抗β-actin鼠單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)和辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)(1∶2 000)，室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法檢測抗原，并采用凝膠成像掃描系統(tǒng)掃描觀察VASA蛋白表達(dá)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1POI患者基本資料

外周血單個(gè)核細(xì)胞來自1例卵巢早衰患者，年齡25歲，因閉經(jīng)1年就診，第1次性激素檢查結(jié)果示FSH 93.99 IU/L，LH 43.35 IU/L；第2次性激素結(jié)果示FSH 70.8 IU/L，LH 50.29 IU/L，無特殊家族史及遺傳病史。

2POI患者特異iPSCs的建系和鑒定

從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，核轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后第12～14天可見呈類圓形的小克隆，與周圍的飼養(yǎng)層細(xì)胞分界清晰，繼續(xù)培養(yǎng)至第19天，可見克隆逐漸增大，邊界清晰，可機(jī)械法挑克隆進(jìn)行傳代。

Oct4、Sox2、Nanog和Tra-1-60為胚胎干細(xì)胞表達(dá)的特異性蛋白，POI患者外周血來源的iPSCs免疫熒光染色結(jié)果也表達(dá)上述干細(xì)胞的特異性蛋白，見圖1。

Figure 1.Immunofluorescence staining of the POI-specific pluripotent protein in the iPSCs. The scale bar=100 μm.

圖1卵巢早衰患者特異性iPSCs多能性蛋白免疫熒光染色結(jié)果

堿性磷酸酶染色是鑒定iPSCs分化狀態(tài)的可靠方法，處于未分化狀態(tài)的iPSCs可著色。iPSCs在體外可形成擬胚體，在體內(nèi)可形成畸胎瘤，可向內(nèi)、外、中3個(gè)胚層的任一種細(xì)胞分化，鏡下可見血管、神經(jīng)和軟骨細(xì)胞,見圖2。

Figure 2.Identification of the POI-specific iPSCs. The scale bar=100 μm. A: karyotype analysis; B: alkaline phosphatase staining; C: embryonic body formation; D: endoderm of teratoma; E: ectoderm of teratoma; F: mesoderm of teratoma.

圖2POI患者特異性iPSCs 鑒定

3POI患者特異iPSCs向原始生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

誘導(dǎo)7 d后，與對照組相比，誘導(dǎo)組原始生殖細(xì)胞標(biāo)志物c-Kit、STELLA和VASA表達(dá)量明顯升高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Oct4組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。同時(shí)，誘導(dǎo)組的VASA蛋白表達(dá)水平明顯升高，對照組VASA蛋白表達(dá)較低，見圖4。

Figure 3.Detection of primordial germ cell marker expression with real-time PCR. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol.

圖3Real-time PCR檢測原始生殖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)變化

討論

卵巢早衰是不孕癥門診中的常見病之一。POI患者雖有自發(fā)性排卵并成功妊娠，但概率也只有5%～10%[14]。目前對卵巢早衰的治療方法主要是根據(jù)患者有無生育要求選擇激素替代治療[15]、贈(zèng)卵胚胎移植[16]或低溫凍存技術(shù)[17](胚胎凍存、卵母細(xì)胞和卵巢組織凍存技術(shù))。而激素替代治療只能改善患者的圍絕經(jīng)期癥狀，對不孕癥的治療效果不顯著；贈(zèng)卵胚胎移植和低溫凍存技術(shù)雖然在一定程度上有效解決患者的生育問題，但由于面對來源匱乏、宗教信仰和倫理道德問題在一定程度上受到限制。

Figure 4.The expression of VASA protein detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖4Western blot檢測VASA蛋白表達(dá)的變化

2007年iPSCs技術(shù)的興起，為人類研究難治性疾病發(fā)病機(jī)制、新藥研發(fā)提供了細(xì)胞模型，也為卵巢早衰的治療帶來新的希望。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源廣泛，本研究采用的外周血單個(gè)核細(xì)胞與其它來源的如皮膚成纖維細(xì)胞、羊水細(xì)胞[12, 18]等體細(xì)胞相比，具有極大的優(yōu)勢，如來源方便、創(chuàng)傷性小，且在體外誘導(dǎo)時(shí)間短、誘導(dǎo)過程中發(fā)生突變的可能性最小[19-20]，這使外周血成為本研究iPSCs的主要來源,而且卵巢早衰患者外周血易獲得且具有特異性，無免疫排斥反應(yīng)，也無道德倫理問題。

POI的致病因素可能與遺傳因素、醫(yī)源性因素、免疫性因素和環(huán)境因素有關(guān)。對于遺傳因素引起的POI患者，需進(jìn)行與POI相關(guān)基因的家族性檢測，從而修飾相關(guān)基因，達(dá)到治療目的；而醫(yī)源性、免疫性和環(huán)境因素引起的POI，實(shí)質(zhì)上只是引起性腺器官的損害，從而造成一系列內(nèi)分泌紊亂和生育問題，而抽取這類患者的外周血，可以去除患者自身免疫因素和外源性因素造成的影響，從而獲得無缺陷的POI患者來源的iPSCs,在應(yīng)用方面免除了因POI缺陷造成的危險(xiǎn)。

加上本研究所采用的無外源性基因整合的改良o(jì)riP/EBNA1質(zhì)粒載體[21]，包括pEB-C5和pEB-Tg，前者表達(dá)Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4和Lin28重編程因子，后者表達(dá)SV40 T抗原，這一改良質(zhì)粒通過順式作用原件oriP和反式作用因子EBNA1基因可使oriP/EBNA1載體獨(dú)立于宿主基因組外進(jìn)行穩(wěn)定復(fù)制，并隨著iPSCs細(xì)胞的不斷增殖，oriP/EBNA1載體在細(xì)胞第10～12代后可自行消失，并且顯著提高了細(xì)胞重編程效率。

近年來國內(nèi)外有關(guān)用iPSCs向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化來治療卵巢早衰的報(bào)道。2009年P(guān)ark等[22]將皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPSCs通過與性腺細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)其向PGCs分化；2013年Lai等[23]將人羊水細(xì)胞重編程為羊水干細(xì)胞，并植入卵巢早衰小鼠模型的卵巢中，最終有卵子產(chǎn)生，成功修復(fù)了卵巢功能；2015年Leng等[8]將卵巢早衰患者皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPSCs在體外通過添加細(xì)胞因子誘導(dǎo)其向PGCs分化；同年Irie等[24]在體外通過繁瑣的誘導(dǎo)方法和添加至少5種細(xì)胞因子將人iPSCs向原始生殖細(xì)胞分化。以上研究表明iPSCs在體內(nèi)可借助卵巢微環(huán)境的作用，使得干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞，甚至向卵母細(xì)胞分化，但在體外，可能由于缺少內(nèi)環(huán)境的影響，目前只能將iPSCs誘導(dǎo)至原始生殖細(xì)胞階段，未進(jìn)入減數(shù)分裂，使iPSCs向女性生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化陷入瓶頸。

原始生殖細(xì)胞起源于移植后6.25 d 的胚胎外胚層[25]，為促使iPSCs向外胚層分化， TGF家族成員TGF-β1有利于維持干細(xì)胞的自我更新并使iPSCs向外胚層樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，獲得向PGCs分化的能力[24]。 BMP4是TGF超家族最大成員，胚外外胚層分泌BMP4，第5.5天至6.5天的胚外胚層在BMP4的誘導(dǎo)下可向原始生殖細(xì)胞分化[25]。TGF-β和BMP4受體活化后通過激活胞內(nèi)Smads因子將信號(hào)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，促進(jìn)外胚層向原始生殖細(xì)胞的形成和分化[26]。本研究通過TGF-β1和BMP4的聯(lián)合作用，通過擬胚體階段，使擬胚體向原始生殖細(xì)胞分化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在誘導(dǎo)組表達(dá)原始生殖細(xì)胞早期階段標(biāo)志物Oct4、STELLA、c-Kit和晚期階段標(biāo)志物VASA。Oct4的表達(dá)對于原始生殖細(xì)胞的存活有重要作用，而STELLA則是iPSCs向原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志，VASA的表達(dá)說明細(xì)胞處于原始生殖細(xì)胞晚期、減數(shù)分裂前階段[27]。

本研究利用POI患者外周血來源的單個(gè)核細(xì)胞重編程為iPSCs,在TGF-β1和BMP4聯(lián)合作用下，通過擬胚體階段誘導(dǎo)iPSCs向原始生殖細(xì)胞階段分化，患者特異性來源的iPSCs不僅具有無免疫排斥反應(yīng)、繼承患者遺傳物質(zhì)，而且誘導(dǎo)方法簡便有效，這為卵巢早衰治療的研究提供細(xì)胞模型和新的治療方法。但是本研究生成的原始生殖細(xì)胞尚未進(jìn)入減數(shù)分裂階段，這與國內(nèi)外大量體外誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的研究一致，可能與體外誘導(dǎo)缺乏成熟生殖細(xì)胞需要的內(nèi)環(huán)境有關(guān)，要想攻克卵巢早衰這一難治性疾病，還需要更深入的研究其向卵母細(xì)胞的分化。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Generation, identification and differentiation of primary ovarian insufficiency patient-derived iPSCs

WEN Yan-fei1, CAI Liu-hong1, HE Wen1, ZENG Min-hui2, JANG Man-bo3

(1CenterforReproductiveMedicine,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2CenterforReproductiveMedicine,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;3DepartmentofReproductiveMedicine,GuangdongProvincialHospitalofChineseMedicine,Guangzhou510006,China.E-mail:cailh@mail.sysu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To generate and identify primary ovarian insufficiency (POI) patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) and to explore their differentiation potential to primordial germ cells. METHODS: Plasmid pEB-C5 expressing reprogramming factors Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 and Lin28, and plasmid pEB-Tg expressing SV40 T antigen, were transfected into peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived from POI patients at the same time. PBMCs were reprogrammed into iPSCs, and the pluripotency of the cells was identified. After supplementation of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4), the mRNA and protein expression of primordial germ cell markers was detected by real-time PCR and Western blot, respectively. RESULTS: iPSCs derived from the PBMCs of POI patient differentiated into 3-germ layer cells and maintained pluripotency by the detection of alkaline phosphatase staining, immunofluorescence, embryoid body and teratoma formation. After addition of TGF-β1 and BMP4, the primordial germ cell markers, including stem cell growth factor receptor (c-Kit), developmental pluripotency-associated 3 (STELLA/DPPA3) and DEAD box polypeptide 4 (VASA/DDX4) were increased at mRNA level (P<0.05), and VASA/DDX4 was also up-regulated at protein level in induced group. CONCLUSION: PBMCs of POI patient are reprogrammed into integration-free iPSCs in vitro and maintain pluripotency. They differentiate into primordial germ cells by adding TGF-β1 and BMP4.

[KEY WORDS]Primary ovarian insufficiency; Induced pluripotent stem cells; Primordial germ cells

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0140- 06

[收稿日期]2015- 10- 14[修回日期] 2015- 11- 17

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81170533)；廣東省科技計(jì)劃(No. 2013B021800091)；廣東省大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃(No. 20132049)

通訊作者△Tel: 020-85256335; E-mail: cailh@mail.sysu.edu.cn

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.024