彭曉燕, 張海鑫, 郭菲菲, 孫向榮, 公衍玲, 徐 珞△
(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,山東 青島266021; 2吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021;3青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東 青島266021)
Orexin-A對(duì)肥胖抵抗大鼠和高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠攝食和自由活動(dòng)的影響*
彭曉燕1,張海鑫2,郭菲菲1,孫向榮1,公衍玲3,徐珞1△
(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,山東 青島266021;2吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021;3青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東 青島266021)
[摘要]目的: 探討肥胖抵抗(OR)大鼠、高脂飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)大鼠及正常SD大鼠的攝食量和自由活動(dòng)量的差異及食欲肽(orexin-A)在其中的作用。方法: 分別于OR、DIO和SD大鼠下丘腦頭端外側(cè)區(qū)(rLHa)埋置套管,經(jīng)套管注射不同劑量(0、31.25、62.5、125和250 pmol)的orexin-A,觀察大鼠2 h內(nèi)攝食量和自由活動(dòng)情況;采用real-time PCR檢測(cè)下丘腦和rLHa prepro-orexin、orexin-A受體(OX1R)和 orexin-B受體(OX2R)的 mRNA表達(dá);采用放射免疫分析法檢測(cè)下丘腦和rLHa OX1R和OX2R的蛋白含量。結(jié)果: rLHa微量注射orexin-A可顯著增加OR、DIO和SD大鼠的攝食量(P<0.05);rLHa微量注射orexin-A后,OR和SD大鼠的自由活動(dòng)量比DIO大鼠顯著增高(P<0.05)。OR大鼠rLHA OX1R和OX2R的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于DIO和SD大鼠(P<0.05)。結(jié)論: 下丘腦orexin-A參與肥胖和正常大鼠能量代謝調(diào)控,其中對(duì)OR大鼠的調(diào)控效應(yīng)最佳。
[關(guān)鍵詞]肥胖抵抗大鼠; 飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠; 攝食; 自由活動(dòng)量; 食欲肽A
食欲肽A(orexin-A,OXA)是一種參與攝食和覺(jué)醒功能的神經(jīng)肽,主要表達(dá)于下丘腦外側(cè)區(qū)、背外側(cè)部及穹窿周區(qū)[1-3]。Orexin神經(jīng)元呈輻射狀分布在大腦的各個(gè)區(qū)域,并通過(guò)不同機(jī)制調(diào)控覺(jué)醒和攝食行為[2, 4]。Orexin神經(jīng)元可投射至黑質(zhì)中支配紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元,后者是調(diào)節(jié)自由活動(dòng)的關(guān)鍵。有文獻(xiàn)報(bào)道,orexin缺乏時(shí)大鼠的自由活動(dòng)量和攝食量同時(shí)減少,但體重明顯增加,表明大鼠自由活動(dòng)量的變化對(duì)體重的影響大于能量攝入[2-3]。雄性SD大鼠長(zhǎng)期喂飼高能量飲食后,可表現(xiàn)出不同的體重增加模式,大約50%大鼠體重顯著增長(zhǎng),稱之為飲食誘導(dǎo)肥胖(diet-induced obese,DIO)大鼠;而另一半體重保持不變的為肥胖抵抗(obesity-resistant,OR)大鼠。OR大鼠雖然攝食量增加,但其體重可維持相對(duì)狀態(tài),可能與其活動(dòng)量明顯增多有關(guān)[5]。目前對(duì)調(diào)控DIO和OR大鼠自由活動(dòng)量的中樞機(jī)制仍不清楚。本研究擬采用下丘腦頭端外側(cè)區(qū)(rostral lateral hypothalamic area,rLHa)微量注射OXA的方法,觀察大鼠的攝食量和自由運(yùn)動(dòng)量改變及機(jī)制。
材料和方法
1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量220~250 g,月齡2~4個(gè)月,由青島市藥物檢驗(yàn)所提供。置于室溫(25±2) ℃,12 h晝夜循環(huán)光照條件下飼養(yǎng)。自由攝食、飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合“青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用管理方法”。
2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
大鼠腦立體定位儀(Scientifica);ANY-maze視頻分析系統(tǒng)(Stoelting);orexin-A(Sigma)。
3實(shí)驗(yàn)方法
3.1DIO大鼠和OR大鼠模型的建立[6]選取成年雄性SD大鼠312只,其中214只給予高能量飲食(配方為80%基礎(chǔ)飼料,10%蛋黃粉,10%豬油)喂養(yǎng)8周,其余98只大鼠給予正常動(dòng)物飼料喂養(yǎng)8周,造模期間所有大鼠均自由飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠麻醉下腹主動(dòng)脈取血,檢測(cè)體重、血脂、血清瘦素和胰島素水平,以體重比正常組大鼠增加15%且Lee′s指數(shù)比正常組增加1.5%作為肥胖大鼠建模指標(biāo),共99只OR大鼠和103只DIO大鼠制備成功。
3.2rLHa埋置套管大鼠在戊巴比妥鈉(50 ng/kg)麻醉下行外科手術(shù)。參照Paxinos和Watson腦圖譜,將大鼠置于腦立體定位儀,在rLHa植入一同芯套管(定位:前囟后2.2 mm,旁開(kāi)1.9 mm,深7.3 mm),并固定于顱骨表面。術(shù)后7 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3.3大鼠自由活動(dòng)量檢測(cè)采用Any-maze視頻分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)并記錄大鼠自由活動(dòng)。將大鼠置于1 m×1 m×1.5 m自由活動(dòng)測(cè)量箱內(nèi),箱內(nèi)安裝可記錄大鼠自由活動(dòng)情況的視頻攝像機(jī)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將圖像傳入計(jì)算機(jī)并自動(dòng)分析,統(tǒng)計(jì)大鼠在箱內(nèi)0~2 h的活動(dòng)距離。
3.4Real-time PCR實(shí)驗(yàn)DIO、OR和SD大鼠各10只,隨機(jī)分為2組,大鼠斷頭取腦,參照Paxinos-Watson大鼠腦圖譜分離下丘腦(5只)或rLHa(5只),迅速加入1 mL冰凍TRIzol勻漿。用Trizol reagent方法提取總RNA,NanoORop紫外線分光光度計(jì)測(cè)定總mRNA濃度和純度。
取1 μL總RNA,以O(shè)ligo (dT)為引物,按試劑盒說(shuō)明書(shū)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以生成的ss-cDNA為模板,然后加入TaqDNA聚合酶以及prepro-orexin、orexin-A受體(orexin-A receptor,OX1R)和orexin-B受體(orexin-B receptor,OX2R)特異性引物,β-actin作為內(nèi)參照。擴(kuò)增反應(yīng)用SYBR GreenⅠ定量PCR試劑盒和5700型定量PCR儀完成。擴(kuò)增條件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 30 s;60 ℃(preproorexin)或59 ℃(OX1R/OX2R)20 s;72 ℃ 15 s;40個(gè)循環(huán)。隨后觀察該P(yáng)CR產(chǎn)物的熔解曲線[94 ℃ 0 s,84 ℃(OX1R)、82 ℃(OX2R)或79 ℃(prepro-orexin)15 s,94 ℃ 0 s;溫度變化速度為0.1 ℃/s],并由電腦自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。Real-time PCR引物由上海生工合成,引物序列見(jiàn)表1。
表1 引物序列
3.5放射免疫法檢測(cè)OX1R 和OX2R DIO、OR和SD大鼠各18只進(jìn)行放射免疫測(cè)定。放射免疫試劑盒由Phoenix提供,大鼠腦區(qū)內(nèi)OX1R 和OX2R的提取和放免檢測(cè)嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先配制OX1R 或OX2R標(biāo)準(zhǔn)液(將OX1R 或OX2R標(biāo)準(zhǔn)品用PBS緩沖液稀釋成每100 μL分別含2.5、5、10、20、40、80、160、320、640和1 280 pg);OX1R 或OX2R抗血清用PBS稀釋至1∶8 000(OX1R 或OX2R純品和抗OX1R 或OX2R兔血清均為Sigma產(chǎn)品)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完畢,迅速斷頭取腦,將腦置于煮沸的生理鹽水中煮5 min;吸干、分離下丘腦(9只)或下丘腦背外側(cè)核(9只)、稱質(zhì)量,加1 mol/L鹽酸1.0 mL制成勻漿,室溫下靜置100 min。然后加1 mol/L氫氧化鈉1 mL中和,4 000 r/min離心20 min,取上清液測(cè)定。測(cè)定程序:各管加[125I]-OX1R 或[125I]-OX2R 100 μL,抗OX1R 或OX2R血清100 μL。樣品管加100~200 μL,標(biāo)準(zhǔn)管加OX1R 或OX2R 100 μL,最后以磷酸緩沖液補(bǔ)足總反應(yīng)體積為500 μL;4 ℃冰箱內(nèi)孵育24 h;各管加1∶3羊抗兔血清100 μL,繼續(xù)孵育24 h,4 000 r/min離心20 min,棄上清液。測(cè)沉淀物的CPM,根據(jù)同批測(cè)定管的OX1R 或OX2R競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線,求取每mg組織中OX1R或OX2R的含量。
3.6Orexin-A對(duì)大鼠攝食量和自由活動(dòng)量的影響將DIO、OR和SD大鼠分別隨機(jī)分為2組(每組7只),實(shí)驗(yàn)組大鼠rLHa分別微量注射0.5 μL orexin-A(31、25、62.5、125和250 pmol);對(duì)照組大鼠下丘腦背外側(cè)核注射0.5 μL生理鹽水,給藥后1 h和2 h測(cè)定大鼠攝食量。
大鼠自由活動(dòng)量檢測(cè)前,先將大鼠在測(cè)量箱內(nèi)適應(yīng)140 min。DIO、OR和SD大鼠隨機(jī)分為2組(每組7只),實(shí)驗(yàn)組大鼠rLHa微量注射0.5 μL orexin-A(31.25、62.5、125和250 pmol);對(duì)照組大鼠下丘腦背外側(cè)核注射0.5 μL NS,注射后1 h和2 h監(jiān)測(cè)大鼠自由活動(dòng)。
4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
用SPSS 18.0和Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩個(gè)獨(dú)立樣本組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差分析后各組均數(shù)間兩兩比較采用q檢驗(yàn)(SNK法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
1rLHa注射OXA對(duì)大鼠攝食量的影響
DIO、OR或SD大鼠rLHa分別微量注射N(xiāo)S以及31.25、62.5、125和250 pmol OXA,觀察大鼠0~2 h攝食量,結(jié)果見(jiàn)表2。
分析0~1 h攝食量可見(jiàn)OR大鼠的攝食量明顯多于DIO大鼠和SD大鼠(P<0.05);DIO大鼠的攝食量與SD大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NS組相比,rLHa注射高劑量(62.5、125和250 pmol)OXA可顯著促進(jìn)各組大鼠的攝食量(P<0.05);但高劑量組之間大鼠攝食量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且注射相同高劑量OXA(62.5、125或250 pmol)時(shí),OR大鼠的攝食量明顯大于DIO大鼠和SD大鼠(P<0.05)。
分析1~2 h的攝食量可見(jiàn),與NS組相比,rLHa注射不同劑量OXA (31.25、62.5、125和250 pmol), DIO、OR和SD大鼠攝食量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rLHa注射相同劑量OXA時(shí),OR大鼠和DIO大鼠的攝食量之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但OR大鼠的攝食量顯著大于SD大鼠(P<0.05);DIO大鼠的攝食量顯著大于SD大鼠(P<0.05)。結(jié)合0~1 h數(shù)據(jù)可推測(cè),OXA對(duì)攝食量的作用在0~1 h內(nèi)逐漸達(dá)到峰值,在1~2 h逐漸下降。
表2 rLHa注射OXA對(duì)DIO、OR和SD大鼠攝食量的影響
*P<0.05vsDIO rats with the same treatment;#P<<0.05vsSD rats with the same treatment;△P<0.05vsNS.
2rLHa注射OXA對(duì)大鼠自由活動(dòng)量的影響
DIO、OR和SD大鼠經(jīng)rLHa分別注射N(xiāo)S以及31.25、62.5、125和250 pmol OXA,觀察大鼠0~2 h活動(dòng)量,結(jié)果見(jiàn)圖1。
分析0~1 h的自由活動(dòng)量可見(jiàn)OR大鼠的活動(dòng)量明顯多于DIO大鼠和SD大鼠(P<0.05)。與對(duì)照組相比,rLHa注射高劑量(62.5、125和250 pmol)OXA可顯著促進(jìn)各組大鼠的活動(dòng)量(P<0.05);但高劑量組之間大鼠活動(dòng)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且注射相同高劑量OXA(62.5、125或250 pmol)時(shí),OR大鼠的活動(dòng)量明顯大于DIO大鼠和SD大鼠(P<0.05)。
分析1~2 h的自由活動(dòng)量可見(jiàn),與對(duì)照組相比,rLHa注射不同劑量OXA (31.25、62.5、125和250 pmol), DIO、OR和SD大鼠活動(dòng)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rLHa注射相同劑量OXA時(shí),DIO大鼠和SD大鼠的活動(dòng)量并無(wú)顯著差異,但OR大鼠活動(dòng)量大于DIO大鼠和SD大鼠(P<0.05)。結(jié)合0~1 h數(shù)據(jù)可推測(cè),OXA對(duì)自由活動(dòng)量的影響在0~1 h內(nèi)逐漸達(dá)到峰值,在1~2 h逐漸下降。
Figure 1. The effect of OXA injection in rLHa on spontaneous physical activity of DIO, OR and SD rats. Mean±SD.n=7.*P<0.05vsDIO rats with the same treatment;#P<0.05vsSD rats with the same treatment;△P<0.05vsNS.
圖1rLHa注射OXA對(duì)DIO、OR和SD大鼠自由活動(dòng)量的影響
3下丘腦和rLHa prepro-orexin、OX1R和OX2R 的mRNA表達(dá)
OR大鼠rLHa OX1R和OX2R的mRNA表達(dá)均顯著高于DIO大鼠和OR大鼠(P<0.05);但3種大鼠rLHa的prepro-orexin以及下丘腦prepro-orexin、OX1R和OX2R的 mRNA表達(dá)均無(wú)顯著差異,見(jiàn)表3。
表3 下丘腦和rLHa prepro-orexin、OX1R和OX2R mRNA的表達(dá)
*P<0.05vsSD rats;#P<0.05vsDIO rats.
4下丘腦和rLHa OX1R和OX2R蛋白表達(dá)的改變
放射免疫分析結(jié)果顯示,OR大鼠rLHa的 OX1R和OX2R含量均顯著高于DIO大鼠和SD大鼠(P<0.05);DIO大鼠rLHa 的OX1R和OX2R明顯高于SD大鼠(P<0.05),但DIO、OR和SD大鼠的整個(gè)下丘腦內(nèi)OX1R和OX2R的表達(dá)均無(wú)顯著差異,見(jiàn)表4。
表4 下丘腦和rLHa OX1R和OX2R蛋白的含量
*P<0.05vsSD rats;#P<0.05vsDIO rats.
討論
為探討DIO及OR大鼠攝食行為和自由活動(dòng)的差異,我們選擇正常SD大鼠作為參照。本實(shí)驗(yàn)大鼠于rLHa注射OXA引起的攝食行為與之前學(xué)者們[3, 7-8]的研究結(jié)果基本一致,都證實(shí)了在中樞OXA促進(jìn)大鼠的自由活動(dòng)[7, 9-10]和能量消耗[11-12]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),OXA誘導(dǎo)大鼠攝食量的增加主要體現(xiàn)于0~1 h攝食量的增加;而OXA誘導(dǎo)的自由活動(dòng)量增加主要體現(xiàn)在0~2 h階段,即由OXA誘發(fā)的單位時(shí)間段內(nèi)的攝食量及自由活動(dòng)量變化不同,可能是攝食和自由活動(dòng)的調(diào)節(jié)通過(guò)2種不同的作用通路。此外,OR大鼠rLHa OX1R 和OX2R的 mRNA含量明顯高于DIO大鼠,推測(cè)rLHa注射相同劑量OXA后OR大鼠活動(dòng)量大于DIO和SD大鼠的原因可能是OXA通過(guò)rLHa的OX1R和OX2R信號(hào)因子發(fā)揮作用。
本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,與DIO和SD大鼠相比,OR大鼠具有較大的基礎(chǔ)自由活動(dòng)量,且注射相同劑量OXA,OR大鼠有著更高的攝食量和自由活動(dòng)量。但OR大鼠對(duì)OXA反應(yīng)敏感的作用機(jī)制現(xiàn)還不清楚,可能是OR大鼠下丘腦OXA受體表達(dá)量較高,為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè),我們檢測(cè)了OR及DIO大鼠下丘腦OX1R 和OX2R的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OR大鼠rLHa內(nèi)OX1R 和OX2R 的mRNA表達(dá)均比DIO大鼠顯著增多,提示OXRs的增加和OXA引起攝食量和自由活動(dòng)量的增加是同步進(jìn)行的,OX1R和OX2R這2種受體亞型均有可能參與攝食及自由活動(dòng)的調(diào)節(jié)過(guò)程。此外我們還測(cè)定了整個(gè)下丘腦的prepro-orexin和OXRs的mRNA表達(dá)水平,以判斷orexins在DIO和OR大鼠的表達(dá)是否相同。結(jié)果顯示DIO和OR大鼠下丘腦prepro-orexin和OXRs的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,我們推測(cè)下丘腦內(nèi)有多種食欲肽,雖各種食欲肽的mRNA表達(dá)有顯著差異,但總體水平相當(dāng)。
此外,放射免疫研究顯示OR大鼠rLHa 的OX1R和OX2R含量明顯高于DIO和SD大鼠,而整個(gè)下丘腦區(qū)域的OX1R或OX2R含量無(wú)顯著差異,與rLHa區(qū)OXRs的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)OR和DIO大鼠之間自由活動(dòng)量的差異可能是導(dǎo)致其體重變化的重要因素之一[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道,DIO和OR大鼠對(duì)OXA誘導(dǎo)攝食和能量代謝效應(yīng)的差異可能與中樞單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)[13]、瘦素[14-15]以及胰島素[16]功能活動(dòng)有關(guān),但具體機(jī)制不清。
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(責(zé)任編輯: 陳妙玲, 羅森)
Effects of orexin-A on food intake and spontaneous physical activity in obesity-resistant rats and high-fat diet-induced obese rats
PENG Xiao-yan1, ZHANG Hai-xin2, GUO Fei-fei1, SUN Xiang-rong1, GONG Yan-ling3, XU Luo1
(1DepartmentofPhysiology,QingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266021,China;2TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China;3CollegeofChemicalEngineering,TsingtaoUniversityofScience&Technology,Qingdao266021,China.E-mail:xu.luo@163.com)
[ABSTRACT]AIM: To investigate the differences of food intake and spontaneous physical activity (SPA) among obesity-resistant (OR) rats, diet-induced obese (DIO) rats and normal Sprague-Dawley (SD) rats and the role of orexin-A in these processes. METHODS: The rostral lateral hypothalamic area (rLHa) catheter was implanted into the OIO, OR, and SD rats. Orexin A at doses of 0, 31.25, 62.5, 125 and 250 pmol was injected through the catheter. The SPA and food intake were measured and recorded for 2 h after injection. The mRNA expression of prepro-orexin, orexin-A receptor (OX1R) and orexin-B receptor (OX2R) in the rLHa and hypothalamus of OR, DIO and SD rats was detected by real-time PCR. The protein expression of OX1R and OX2R in the hypothalamus and rLHa of the rats was measured by radioimmunoassay. RESULTS: A small-dose injection of orexin-A into rLHa significantly increased the food intake in all the rats. Orexin A-induced SPA had significant differences, showing that the OR and SD rats had the higher motion than the DIO rats. The mRNA and protein levels of OX1R and OX2R in the rLHa of OR rats were significantly higher than those in DIO and SD rats. CONCLUSION: Hypothalamic orexin-A participates in the regulation of energy metabolism in obese and normal rats, in which the regulatory effect on OR rats is the best.
[KEY WORDS]Obesity-resistant rats; Diet-induced obese rats; Food intake; Spontaneous physical activity; Orexin-A
[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0046- 05
[收稿日期]2015- 06- 25[修回日期] 2015- 10- 27
*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270460;No. 81470815;No. 81500414);山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金資助項(xiàng)目(No. BS2014YY009);青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃(No.14-2-3-3-nsh)
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[中圖分類(lèi)號(hào)]R363
[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A
doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.008