趙　雷，　陳　昕，　馮業(yè)童，　劉朋飛

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院 1 麻醉科， 2檢驗科，廣東 深圳 518020； 3中山大學(xué)人類病毒學(xué)研究所，廣東 廣州 510080； 4吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長春 130021)

過表達IGF-1對臍帶間充質(zhì)干細胞氧化損傷的抑制作用*

趙雷1，陳昕2，馮業(yè)童3，劉朋飛4△

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院1麻醉科，2檢驗科，廣東 深圳 518020；3中山大學(xué)人類病毒學(xué)研究所，廣東 廣州 510080；4吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長春 130021)

[摘要]目的： 分析過表達胰島素樣生長因子1(IGF-1)對臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)氧化損傷的抑制作用，開發(fā)UC-MSCs新的應(yīng)用模式。方法: 通過酶消化法，從臍帶組織中分離UC-MSCs，并采用流式細胞術(shù)對細胞的表面特異標志物進行鑒定，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體系，構(gòu)建過表達IGF-1的UC-MSCs(UC-MSCs-IGF-1)，并進一步通過實時熒光定量PCR和流式細胞術(shù)對UC-MSCs-IGF-1的IGF-1表達水平進行評價，同時分析UC-MSCs-IGF-1的表面標志物及成骨成脂分化能力；用不同濃度的H2O2(0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L)處理細胞，分析UC-MSCs-IGF-1在增殖活力維持、抗氧化損傷和抗凋亡方面的優(yōu)勢。結(jié)果: UC-MSCs表面標志物CD29、CD90和CD105的表達均呈陽性，而CD34的表達為陰性，符合正常間充質(zhì)干細胞的表型特征；實時熒光定量PCR和流式細胞術(shù)結(jié)果表明，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體系構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1在IGF-1表達方面遠高于正常UC-MSCs，同時干細胞表型與UC-MSCs一致，且具備正常的成脂成骨分化能力；在H2O2的氧化損傷作用下，與UC-MSCs相比，UC-MSCs-IGF-1具有較強的增殖活力和抗氧化、抗凋亡功能，同時細胞中的SOD活性略高于UC-MSCs。結(jié)論: 過表達IGF-1對UC-MSCs的氧化損傷及氧化引起的凋亡均具有一定的防護作用，與正常UC-MSCs相比，UC-MSCs-IGF-1可能在臨床應(yīng)用方面具有一定的優(yōu)勢。

[關(guān)鍵詞]臍帶間充質(zhì)干細胞； 胰島素樣生長因子1； 氧化損傷；細胞凋亡

近年來，以干細胞特別是成體干細胞為基礎(chǔ)的新型治療模式，已在多種疾病的治療上進行了深入研究[1-4]。臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)具有多向分化潛能，還能夠遷移至受損組織處，通過分泌營養(yǎng)因子促進損傷組織修復(fù)，在體內(nèi)發(fā)揮功能的過程中未見成瘤性[5-6]。同時，UC-MSCs的免疫學(xué)特性也在很大程度上擴寬了它的應(yīng)用范圍，這種細胞不僅具有免疫調(diào)節(jié)能力，而且，基于自身的低免疫源性特點，該細胞在異體移植方面也具有著較好的應(yīng)用前景[3, 7-9]。

胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor-1，IGF-1)是一種結(jié)構(gòu)類似胰島素的多肽類細胞因子，主要在肝臟合成，是具有促進細胞分化和增殖作用的單鏈蛋白，生物作用廣泛，參與機體多種器官功能調(diào)節(jié)，在人和脊椎動物的胚胎發(fā)育和機體正常成長發(fā)育過程中起著重要作用[10]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)IGF-1具有一定的抗氧化損傷的作用，該功能在多種細胞氧化損傷的抑制方面均得到了一定驗證，即在細胞培養(yǎng)體系中加入IGF-1，可以起到抵抗氧化損傷的作用[11-12]。但是，IGF-1對UC-MSCs的氧化損傷抑制作用尚不明確。此外，這種技術(shù)模式需要持續(xù)給予外源的IGF-1，對許多應(yīng)用方面具有一定的局限性。

針對這些問題，本課題組擬通過基因調(diào)控技術(shù)，使UC-MSCs能持續(xù)表達IGF-1，探索過表達IGF-1的UC-MSCs在抗氧化功能方面的優(yōu)越性，為UC-MSCs在臨床方面的合理化應(yīng)用提供一定的理論參考和技術(shù)支持。

材料和方法

1主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco；TRIzol RNA提取液購自Invitrogen；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒均購自TaKaRa；所有引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成；CCK-8試劑盒購自Dojindo；人源CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC和IGF-1-PE單克隆抗體均購自BD；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色試劑盒、油紅O(oil red O)染色試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)分型測試盒購自南京建成生物工程研究所。

IX-70倒置相差顯微鏡及正置生物學(xué)顯微鏡均購自日本 Olympus；PCR儀購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；CFX96實時定量PCR儀購自Bio-Rad；FACSCalibur 流式細胞儀購自BD；EXL-808酶標檢測儀購自Bio-Tek。

2實驗方法

2.1人源UC-MSCs的分離和鑒定取分娩后的臍帶組織，用PBS液清洗組織3遍，用眼科剪刀將組織標本剪碎；加IV型膠原蛋白酶(2 g/L)與剪碎組織混勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱消化4 h，3 000 r/min室溫下離心10 min，棄上清液；再添加I型脫氧核糖核酸酶(1 g/L)重懸細胞沉淀，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱消化15 min，按上述離心條件再次離心，棄上清液；添加0.25%胰酶重懸組織細胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱消化15 min，再次離心棄上清液；添加UC-MSCs細胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%胎牛血清)重懸組織細胞，應(yīng)用40 μm細胞容器過濾組織塊，將濾液移入鋪有明膠的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

收集第3代的UC-MSCs進行后續(xù)的檢測和評價。在表面特異標記檢測方面，將1×106UC-MSCs懸浮于0.1 mL PBS中，人源CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC和CD105-FITC單克隆抗體均按1∶50的稀釋比例與UC-MSCs混合，室溫孵育30 min后，用PBS清洗2次，通過流式細胞儀檢測細胞表面標記。另一方面，對細胞在成骨分化和成脂分化方面的能力進行評價，分別采用成骨分化培養(yǎng)基(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，附加地塞米松10-4mmol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L和維生素C 50 mg/L)和成脂分化培養(yǎng)基(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，附加地塞米松10-3mmol/L、胰島素10 mg/L、IBMX 0.5 mmol/L和吲哚美辛0.2 mmol/L)對細胞進行培養(yǎng)，隔日換液1次，培養(yǎng)3～4周后，分別用AP染色和油紅O染色評價細胞的分化潛能，具體分化方法及檢測同參考文獻[4]。

2.2過表達IGF-1的UC-MSCs的構(gòu)建pMX-IGF-1過表達載體由吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程實驗中心提供。本課題中采用293T細胞制備逆轉(zhuǎn)錄病毒，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法構(gòu)建過表達IGF-1的UC-MSCs(UC-MSCs-IGF-1)。具體實驗方法同參考文獻[13-14]。

對本課題所構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1其細胞表面標記、成骨分化能力和成脂分化能力進行評價，方法同2.1。此外，分別通過實時熒光定量PCR和流式細胞術(shù)方法檢測細胞過表達IGF-1的程度。同時，通過實時熒光定量PCR檢測UC-MSCs-IGF-1干細胞標志物的表達情況。收集構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1，用TRIzol裂解，提取細胞RNA，并進一步通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得細胞基因組cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測UC-MSCs-IGF-1中相關(guān)基因的表達程度，檢測過程中以正常UC-MSCs和轉(zhuǎn)染空載體的UC-MSCs-vector為對照組，具體操作按照試劑盒說明書進行，引物序列見表1。

2.3過表達IGF-1的UC-MSCs的抗氧化損傷能力分析分別將正常UC-MSCs、UC-MSCs-vector和UC-MSCs-IGF-1，以每孔2×103cells的數(shù)量接種到96孔板中，每組細胞進一步用不同濃度的H2O2(0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L)進行作用處理，采用CCK-8試劑盒檢測細胞在H2O2作用24 h、48 h后的細胞活力，評價各實驗組的抗氧化能力，用僅含培養(yǎng)基的組作為背景組，測量絕對吸光度(實驗組絕對吸光度值=實驗組吸光度值-空白組吸光度值)，每組設(shè)4個復(fù)孔，具體操作按CCK-8試劑盒說明書進行。另一方面，將細胞以每孔2×105cells的數(shù)量接種到6孔板中，處理方法及分組同上，直接用細胞計數(shù)器在鏡下計數(shù)細胞，結(jié)合CCK-8實驗觀察的細胞活力結(jié)果，觀察UC-MSCs-IGF-1的增殖能力。

收集各實驗組細胞，采用MDA測定試劑盒和SOD分型測試盒檢測各組細胞MDA 的含量及SOD的活性，觀察過表達IGF-1對細胞凋亡和SOD活性的影響，進一步明確各組細胞的抗氧化能力。具體操作按試劑盒說明書進行。

2.4過表達IGF-1的UC-MSCs在抗氧化損傷過程中的凋亡相關(guān)基因分析在H2O2作用48 h后，收集各個實驗組的RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測各組細胞凋亡基因caspase-3、bax和抗凋亡基因bcl-2的表達程度，從而明確各組細胞的凋亡情況。在凋亡基因檢測中，以β-actin作為內(nèi)參照，將正常UC-MSCs作為空白對照組，并將基因在空白對照組的表達水平作為“1”，通過等比例比較各實驗組的基因表達水平。實時熒光定量PCR所用引物序列見表1。

3統(tǒng)計學(xué)處理

（2）改善鉆井液潤滑性。施工中通過加入1%油基潤滑劑來優(yōu)化鉆井液潤滑性，作用機理是在親水性的井壁和鉆具表面形成一層疏水性油膜，在增強吸附表面潤滑性的同時，也有助于抑制泥頁巖吸水膨脹分散，降低摩阻。若是摩阻較大的定向井，可向鉆井液中加入10% 原油，并使其充分乳化，以改善鉆井液的潤滑性能和摩阻，阻止壓差卡鉆現(xiàn)象的發(fā)生［1］。

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，并用SNK-q檢驗進行各組之間的兩兩比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　引物序列

F: forward; R: reverse.

結(jié)果

1人源UC-MSCs的分離和鑒定結(jié)果

分離的人源UC-MSCs在培養(yǎng)1 d后，呈長梭形貼壁狀態(tài)生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，可見細胞生長密度逐漸增大，由此說明細胞具有一定的增殖能力。此外，通過流式細胞術(shù)檢測可見UC-MSCs表達CD29、CD90和CD105(表達效率分別為98.1%、97.2%和90.2%)，基本不表達CD34(表達效率為0.52%)，這種表面標記特征與正常的間充質(zhì)干細胞相符合，滿足本課題后續(xù)研究的需要。同時，細胞具備成骨分化和成脂分化的能力，可見分化后的細胞AP染色和油紅O染色均為陽性，見圖1。

2過表達IGF-1的UC-MSCs的構(gòu)建及鑒定

將基因在UC-MSCs-IGF-1組的表達水平定為“1”，通過等比例比較各實驗組的基因表達水平。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，IGF-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后的UC-MSCs，在IGF-1表達方面遠高于正常UC-MSCs以及UC-MSCs-vector，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果與實時熒光定量PCR的結(jié)果相一致，與陰性對照組相比，UC-MSCs、UC-MSCs-vector和UC-MSCs-IGF-1的IGF-1表達效率分別為0.25%、0.32%和97.5%，UC-MSCs-IGF-1中IGF的表達效率遠高于正常UC-MSCs以及UC-MSCs-vector。上述結(jié)果證明本課題中所采用的逆轉(zhuǎn)錄病毒過表達體系效果明顯，可以成功構(gòu)建過表達IGF-1的UC-MSCs，見圖2。

Figure 1.The morphology and identification of human UC-MSCs and UC-MSCs-IGF-1.

圖1人源UC-MSCs及UC-MSCs-IGF-1的形態(tài)及鑒定結(jié)果

3過表達IGF-1的UC-MSCs抗氧化損傷的能力評價結(jié)果

細胞計數(shù)分析結(jié)果的大體趨勢與CCK-8的結(jié)果基本一致。在用10 μmol/L H2O2處理細胞時，細胞的增殖能力并未見顯著變化，隨著H2O2濃度的提高，各實驗組細胞的增殖能力逐漸下降；在用50 μmol/L H2O2處理時，UC-MSCs和UC-MSCs-vector均呈現(xiàn)一定的增殖抑制現(xiàn)象，而UC-MSCs-IGF-1仍然可以呈現(xiàn)一定程度的增殖趨勢；在用100 μmol/L H2O2處理時，各實驗組均呈現(xiàn)明顯的細胞生長抑制，但是，各實驗組的抑制程度具有顯著區(qū)別，作用48 h后，UC-MSCs和UC-MSCs-vector的抑制效率[抑制效率=(0 h相對吸光度-48 h相對吸光度)/0 h相對吸光度×100%]分別為51.9%和51.7%，而UC-MSCs-IGF-1組的抑制效率為16.4%，明顯低于UC-MSCs和UC-MSCs-vector，由此表明UC-MSCs-IGF-1具有一定的抗氧化損傷的作用，見圖3。

對各實驗組SOD的檢測結(jié)果表明，UC-MSCs-IGF-1中SOD的活性水平略高于UC-MSCs和UC-MSCs-vector(P<0.05)，所以UC-MSCs-IGF-1可以在一定程度上抵抗H2O2的氧化損傷，維持細胞活力，見圖4。

Figure 2.Evaluation of UC-MSCs-IGF-1 establishment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsUC-MSCs；#P<0.05vsUC-MSCs-vector.

圖2UC-MSCs-IGF-1的構(gòu)建評價

Figure 3.The proliferation of UC-MSC, UC-MSCs-vector and UC-MSCs-IGF-1 treated with H2O2at different concentrations.A: CCK-8 assay; B: cell counting. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 h；#P<0.05vs24 h.

圖3在不同濃度H2O2的作用下UC-MSCs、UC-MSCs-vector和UC-MSCs-IGF-1的增殖變化

Figure 4.The SOD activity in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsUC-MSCs;#P<0.05vsUC-MSCs-vector.

圖4各實驗組SOD活性的檢測結(jié)果

4過表達IGF-1的UC-MSCs在抗氧化損傷過程中凋亡相關(guān)基因的表達

實時熒光定量PCR檢測的結(jié)果表明，在未經(jīng)H2O2處理或10 μmol/L H2O2處理細胞時，UC-MSCs、UC-MSCs-vector以及UC-MSCs-IGF-1的凋亡基因caspase-3和bas均保持較低水平，而抗凋亡基因bcl-2處于較高的水平，各實驗組未見明顯差異；隨著H2O2濃度的增大，由H2O2引起細胞凋亡逐漸顯著，可見各實驗組均有caspase-3和bax上調(diào)，以及bcl-2下調(diào)的趨勢，但是，各實驗組的細胞凋亡程度各不一致，與UC-MSCs和UC-MSCs-vector相比，UC-MSCs-IGF-1中的caspase-3和bax的上調(diào)程度和bcl-2的下調(diào)程度均較弱，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，MDA的檢測結(jié)果表明，UC-MSCs-IGF-1中MDA的含量略低于UC-MSCs和UC-MSCs-vector(P<0.05)，由此表明UC-MSCs-IGF-1可以在一定程度上抵抗氧化損傷引起的細胞凋亡，見圖5。

Figure 5.Detection of apoptosis-associated gene expression and MDA in each group treated with H2O2at different concentrations. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsUC-MSCs;#P<0.05vsUC-MSCs-vector.

圖5在不同濃度H2O2的作用下各實驗組凋亡相關(guān)基因mRNA表達及MDA的檢測結(jié)果

討論

本研究利用逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建了UC-MSCs-IGF-1，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體系屬于基因組插入模式，所以，所構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1是穩(wěn)定表達IGF-1的UC-MSCs。結(jié)果表明，與正常UC-MSCs相比，UC-MSCs-IGF-1在生長形態(tài)、表面標記、細胞增殖及成骨成脂分化等方面，未見顯著區(qū)別。由此可見，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體系實現(xiàn)的IGF-1過表達，不會影響干細胞的基本生物特性。

IGF-1對細胞氧化損傷的抑制作用已逐漸為研究人員所證實，但是，如何將這一科學(xué)理論應(yīng)用于臨床實踐尚不明確。目前研究表明，通過體外調(diào)控，可以優(yōu)化UC-MSCs的某些生物學(xué)特性，同時，UC-MSCs通過靜脈途徑進入體內(nèi)，對多種疾病均有較好的治療效果[3, 7, 15-16]。但是，正常情況下，人體血液內(nèi)的IGF-1濃度較低，必須在給予UC-MSCs的同時補充IGF-1才能起到抗氧化損傷的效果，這種方法在很大程度上增加了治療成本，同時還需要考慮外源IGF-1在體內(nèi)的作用劑量和作用時間。針對這一問題，本課題采用基因調(diào)控手段構(gòu)建UC-MSCs-IGF-1，證明UC-MSCs-IGF-1在抗氧化損傷、維持細胞增殖活力、抗凋亡等方面，均具有一定的優(yōu)勢。同時，課題組對所建立的UC-MSCs-IGF-1進行了一定時期的體外培養(yǎng)，在構(gòu)建后傳代5次，IGF-1仍然具有較高的表達水平，與初始構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1并無明顯差別。這些特點均在一定程度上為UC-MSCs的臨床合理化應(yīng)用提供了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。但是，本課題對于基因調(diào)控方面的機理機制分析較少，尚不明確過表達IGF-1對細胞內(nèi)其它信號通路及UC-MSCs生物活性的影響；同時，在UC-MSCs-IGF-1抗氧化損傷的能力方面，本課題所建立的體系仍有待進一步優(yōu)化；特別是本課題仍處于體外研究階段，UC-MSCs-IGF-1相關(guān)的體內(nèi)功能仍需要進一步的探索和研究。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Inhibitory effect of IGF-1 overexpression on oxidative damage in umbilical cord mesenchymal stem cells

ZHAO Lei1, CHEN Xin2, FENG Ye-tong3, LIU Peng-fei4

(1DepartmentofAnesthesiology，2DepartmentofLaboratoryMedicine,SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen518020,China;3InstituteofHumanVirology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;4DepartmentofRegenerativeMedicine,SchoolofPharmaceuticalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China.E-mail:rockman123456@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To analyze the inhibitory effect of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) overexpression in umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) on oxidative damage and to develop new application model for UC-MSCs. METHODS: UC-MSCs were isolated from human umbilical cord with enzymatic digestion, and further characte-rized with flow cytometry. IGF-1-overexpressing UC-MSCs (UC-MSCs-IGF-1) were established by retrovirus infection. IGF-1 expression of UC-MSCs-IGF-1 was evaluated by real-time quantitative PCR and flow cytometry, and its surface markers, as well as osteogenic and adipogenic differentiation ability, were further analyzed. The proliferation, anti-oxidative damage and anti-apoptosis abilities of UC-MSCs-IGF-1 were evaluated when treated with H2O2 at different concentrations (0 μmol/L, 10 μmol/L, 50 μmol/L and 100 μmol/L). RESULTS: UC-MSCs showed positive expression of CD29, CD90 and CD105, but negative expression of CD34, which coincided with the normal phenotype of mesenchymal stem cells. UC-MSCs-IGF-1 established with retrovirus infection showed much higher expression of IGF-1 compared with normal UC-MSCs, and expressed the same surface markers as UC-MSCs.The osteogenic and adipogenic differentiation abilities were also observed. With the oxidative damage by H2O2treatment, UC-MSCs-IGF-1 showed more strong proliferation, anti-oxidative damage and anti-apoptosis abilities as compared with normal UC-MSCs. In addition, the activity of SOD in UC-MSCs-IGF-1 was a little higher than that in control group. CONCLUSION: IGF-1 overexpression in UC-MSCs inhibits oxidative damage and cell apoptosis. UC-MSCs-IGF-1 may have more advantagies in clinical application.

[KEY WORDS]Umbilical cord mesenchymal stem cells; Insulin-like growth factor-1; Oxidative damage; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0160- 07

[收稿日期]2015- 06- 02[修回日期] 2015- 11- 05

*[基金項目]深圳市知識創(chuàng)新計劃 (No. JCYJ20140416122812052)；吉林大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項目(No. 2015009)；深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目 (No. 201401010)

通訊作者△Tel: 0431-85619715； E-mail： rockman123456@sina.com

[中圖分類號]R392.32

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.028