尤慧敏，　康祥錦，　楊　潔，　林燕珊，　劉見橋，　杜紅姿

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室,廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室, 廣東 廣州 510150)

EGCG通過調(diào)控SIRT1-P53通路誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV-3細胞凋亡*

尤慧敏，康祥錦，楊潔，林燕珊，劉見橋，杜紅姿△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室,廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室, 廣東 廣州 510150)

[摘要]目的： 研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)調(diào)控人卵巢癌SKOV-3細胞活力和凋亡的分子機制。方法: SKOV-3細胞給予EGCG(0～50 μmol/L)、SIRT1激動劑SRT1720(1 μmol/L)和SIRT1抑制劑EX527(1 μmol/L)處理后，用CCK-8法檢測細胞活力,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,real-time PCR檢測Bax和Bcl-2 mRNA的表達水平；采用SIRT1去乙?；富钚詸z測試劑盒檢測SIRT1酶活性；使用Western blot法檢測SIRT1、乙?；疨53和P53的蛋白表達變化。結(jié)果: 與正常對照組相比，單獨給予EGCG或EX527處理之后SKOV-3細胞活力下降，凋亡率增加；SIRT1的酶活性和蛋白表達水平均明顯下降；P53的乙?；斤@著增加。與EGCG組相比，SRT1720預(yù)處理組的細胞活力上升，凋亡率下降，Bax/Bcl-2的相對比值及激活型caspase-3的蛋白水平明顯下降，并且SIRT1的酶活性和蛋白表達水平顯著增加，P53的乙酰化水平下降。結(jié)論: EGCG可通過調(diào)控SIRT1-P53通路抑制卵巢癌SKOV-3細胞活力并誘導(dǎo)其凋亡。

[關(guān)鍵詞]表沒食子兒茶素沒食子酸酯； SKOV-3細胞； 細胞凋亡； SIRT1-P53通路

卵巢癌是婦科常見腫瘤之一，其死亡率高居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤榜首，且呈逐年上升趨勢。因為卵巢癌缺乏早期癥狀和早期診斷的檢測手段，往往在首次確診時，病灶已擴散至卵巢外。目前采用手術(shù)治療雖可以起到較好的療效，但通常會在短時間內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。除手術(shù)治療外，臨床上主要使用以鉑類和紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案，可延長患者的生存時間，提高生活質(zhì)量。然而由于化療的耐藥時常發(fā)生，并且這種治療方法存在神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓抑制等嚴重不良反應(yīng)，許多患者難以承受，長期生存率未獲改變[2-3]。因此，尋找新型高效、低毒的化療藥物是目前卵巢癌研究的主要方向之一。

天然產(chǎn)物大多具有低毒的特點。近年來研究發(fā)現(xiàn)，很多天然植物分離提取物具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，一些已進入臨床試驗階段，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是目前研究較多的一個[4]。EGCG是綠茶茶多酚的主要成份，具有抗氧化、清除自由基等多種生物活性[5]。研究表明，EGCG對包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞均有明顯的抑制作用，有望成為新型的抗腫瘤化療藥物[5-6]。然而，到目前為止，EGCG調(diào)控卵巢癌細胞增殖與凋亡的具體分子機制并不十分清楚。本實驗使用卵巢癌細胞株SKOV-3作為研究對象，通過觀察不同濃度EGCG對SKOV-3細胞SIRT1-P53通路的調(diào)控作用，初步探討EGCG抑制卵巢癌的分子機制，為進一步將EGCG應(yīng)用于卵巢癌臨床治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1主要試劑和藥品

人卵巢癌細胞株SKOV-3購自上海中科院細胞研究所；高糖培養(yǎng)基DMEM和新生牛血清分別購自Gibco；EGCG(純度>98%)購自Sigma，用超純水配成100 mmol/L，-20 ℃避光保存；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo；細胞凋亡Annexin V-FITC熒光檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；SIRT1去乙?；富钚詸z測試劑盒購自Cycle；SIRT1兔多抗、cleaved caspase-3兔多抗和乙酰化P53 (acetyla-ted P53,Ac-P53)兔多抗購自CST；β-actin小鼠單抗、P53小鼠單抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠和羊抗兔II抗為Santa Cruz產(chǎn)品；SIRT1激動劑SRT1720和抑制劑EX527均購自Selleck，用DMSO配成1 mmol/L，-20 ℃避光保存。各目的基因及內(nèi)參引物以Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體序列見表1。

表1　引物序列

2主要方法

2.1細胞培養(yǎng)與處理人卵巢癌細胞株SKOV-3使用含10%新生牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細胞根據(jù)實驗要求接種至不同規(guī)格的培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后血清饑餓12 h，隨后加入指定濃度的EGCG(0～50 μmol/L)、SIRT1激動劑SRT1720(1 μmol/L)或SIRT1抑制劑EX527(1 μmol/L)培養(yǎng)預(yù)定時間，培養(yǎng)結(jié)束后進行后續(xù)實驗。

2.2SIRT1去乙酰化酶活性檢測接種細胞至60 mm培養(yǎng)皿中，按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞，給藥結(jié)束后檢測SIRT1酶活性。檢測步驟按照SIRT1去乙?；富钚詼y定試劑盒說明書進行。棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，裂解液冰上裂解5～10 min，超聲處理15 s，4 ℃ 14 000×g離心10 min，取上清。加入1 μg SIRT1抗體，4 ℃慢搖2 h，加入15 μL Protein G瓊脂糖微球，4 ℃搖擺過夜，4 ℃ 14 000×g離心30 s，棄上清，用裂解液洗滌沉淀，按照說明書要求配制去乙?；阜磻?yīng)體系，充分混勻后加入避光的96孔板中，采用Tecan多功能酶標儀檢測熒光強度[激發(fā)光波長為(490±10) nm；發(fā)射光波長為(530±10) nm]。

2.3Western blot檢測蛋白表達細胞無血清處理之后，按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞，給藥結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，加入RIPA裂解液提取總蛋白，依次進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)、封閉，4 ℃孵育I抗過夜，室溫孵育II抗1 h，并采用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達情況，使用ImageJ軟件進行條帶灰度分析。

2.4CCK-8法檢測細胞活力接種SKOV-3細胞于96孔板，血清饑餓完成之后，按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞，每組設(shè)6個平行孔。處理結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，450 nm波長處檢測吸光度值A(chǔ)，并計算細胞增殖。細胞活力(%)=實驗組A450/對照組A450×100%。

2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡接種SKOV-3細胞至60 mm平皿中，按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞，處理完成后，棄培養(yǎng)基。收集細胞并計數(shù)，按照Annexin V/PI雙染流式細胞檢測試劑盒說明書對SKOV-3細胞進行染色后，上機檢測，分析細胞凋亡率。

2.6Real-time PCR檢測mRNA的表達按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞，給藥結(jié)束后，使用TRIzol 試劑(Invitrogen)從SKOV-3細胞中提取總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用能與雙鏈DNA 結(jié)合便可發(fā)出熒光的熒光染料SYBR Green(TaKaRa)進行PCR 擴增，通過檢測PCR 反應(yīng)中熒光信號強度，對目的基因進行準確定量。以GAPDH 為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均值±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行多組間分析，各組數(shù)據(jù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1EGCG對人卵巢癌SKOV-3細胞株SIRT1-P53通路的影響

不同濃度EGCG(0、12.5、25和50 μmol/L)處理SKOV-3細胞24 h后，采用SIRT1去乙?；富钚詸z測試劑盒檢測細胞中SIRT1的去乙?；富钚?，利用Western blot實驗檢測SIRT1、Ac-P53和P53的蛋白水平。結(jié)果顯示，隨著EGCG濃度增加，SIRT1的去乙酰化酶活性和蛋白表達顯著下降(P<0.05)，并且P53的乙酰化水平顯著增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of EGCG on SIRT1-P53 signaling pathways in ovarian cancer cell line SKOV-3. SKOV-3 cells were treated with various concentrations (0～50 μmol/L) of EGCG for 24 h. A: SIRT1 deacetylase activity was measured by SIRT1 deacetylase fluorometric assay kit; B: the protein levels of SIRT1, Ac-P53 and P53 were examined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖1EGCG 對卵巢癌SKOV-3細胞SIRT1-P53通路的影響

2EGCG通過抑制SIRT1誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV-3細胞凋亡

為了明確SIRT1在EGCG誘導(dǎo)SKOV-3細胞凋亡中的作用，SKOV-3細胞單獨給予SIRT1抑制劑EX527處理，或使用SIRT1的激動劑SRT1720(1 μmol/L)預(yù)處理SKOV-3細胞之后，再給予EGCG(50 μmol/L)處理24 h，采用CCK-8法檢測SKOV-3細胞活力，并使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。結(jié)果顯示，在SKOV-3細胞中給予SRT1720預(yù)處理之后，EGCG抑制細胞活力和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用被取消(P<0.05)。而單獨給予EX527處理能夠模擬EGCG的作用,從而抑制SKOV-3的細胞活力，并誘導(dǎo)凋亡，見圖2。

Figure 2.SIRT1 participated in the effect of EGCG on the activity and apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3. SKOV-3 cells were treated with 1 μmol/L EX527 or pretreated with 1 μmol/L SRT1720 for 1 h followed by stimulation with EGCG (50 μmol/L) for 24 h. A: cell viability was measured by CCK-8 assay; B: apoptosis was assessed by flow cytometric analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGCG group.

圖2SIRT1參與了EGCG對人卵巢癌細胞SKOV-3活力和凋亡的調(diào)控

3SIRT1參與了EGCG對SKOV-3細胞凋亡相關(guān)基因的影響

為了進一步明確SIRT1在EGCG誘導(dǎo)SKOV-3細胞凋亡中的作用，SKOV-3細胞單獨給予SIRT1抑制劑EX527處理，或給予SRT1720預(yù)處理細胞1 h后，再給予EGCG(50 μmol/L)處理24 h，并分別采用real-time PCR和Western blot的方法檢測凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的水平。結(jié)果表明EGCG可顯著增加Bax的mRNA表達,降低Bcl-2的mRNA表達，Bax/Bcl-2的比值明顯增加(P<0.05)，并且cleaved caspase-3的蛋白水平顯著上升(P<0.05)。而SRT1720預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)EGCG對Bax、Bcl-2以及cleaved caspase-3水平的影響(P<0.05)。單獨給予EX527處理能夠模擬EGCG的作用,增加Bax/Bcl-2的比值和cleaved caspase-3的蛋白水平，見圖3。

Figure 3.SIRT1 participated in the effect of EGCG on the expression of apoptosis-related genes in ovarian cancer cell line SKOV-3. SKOV-3 cells were treated with 1 μmol/L EX527 or pretreated with 1 μmol/L SRT1720 for 1 h followed by stimulation with EGCG (50 μmol/L) for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGCG group.

圖3SIRT1參與了EGCG對人卵巢癌細胞SKOV-3凋亡相關(guān)基因表達的調(diào)控

4EGCG通過抑制SIRT1調(diào)控P53的乙?；?/p>

為了進一步研究EGCG調(diào)控SKOV-3細胞凋亡的分子機制，SKOV3細胞單獨給予SIRT1抑制劑EX527處理，或給予SRT1720預(yù)處理1 h，再給予EGCG處理24 h之后，我們分別檢測了SIRT1的去乙?；富钚砸约癝IRT1和Ac-P53的蛋白水平。結(jié)果表明SRT1720可取消EGCG對SIRT1去乙?；富钚砸约癝IRT1和Ac-P53蛋白水平的影響(P<0.05)，而單獨給予EX527處理能夠抑制SIRT1酶活性和蛋白表達，增加P53的乙?；?提示SIRT1參與了EGCG對其下游P53乙?；降恼{(diào)控作用，見圖4。

討論

卵巢癌因發(fā)病隱匿，易于轉(zhuǎn)移，已成為死亡率最高的婦科惡性腫瘤。目前，卵巢癌術(shù)后化療藥物的毒副作用及耐藥性使得預(yù)后較差。因此，需要尋找高效低毒的藥物與放療聯(lián)合應(yīng)用來提高卵巢癌的治療效果。而EGCG正具備這樣2個特點。大量研究證明EGCG可抑制多種腫瘤細胞增殖誘導(dǎo)凋亡并具有阻止腫瘤細胞的侵襲等生物學(xué)作用[6-8]。在臨床試驗中，受試者單次服用EGCG劑量達1 600 mg或每日服用800 mg，連續(xù)服藥1個月，除可見輕度胃腸道反應(yīng)外，沒有出現(xiàn)明顯的毒副反應(yīng)，提示EGCG的安全性高[4, 9]。關(guān)于EGCG在卵巢癌中的作用也有一定的報道。EGCG可通過激活p38 MAPK通路，下調(diào)MMP-2的蛋白表達從而抑制卵巢癌細胞株OVCAR-3增殖并誘導(dǎo)其凋亡[10]。最近的研究發(fā)現(xiàn)EGCG還可增加順鉑對卵巢癌細胞株的敏感性[7]。在本實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)50 μmol/L的EGCG能夠顯著抑制人卵巢癌SKOV-3的細胞活力，誘導(dǎo)細胞凋亡，提示EGCG可能是一個潛在的治療卵巢癌的化療藥物。然而，關(guān)于EGCG調(diào)控卵巢癌細胞增殖與凋亡的具體分子機制并不十分清楚，值得進一步研究。

近年來，SIRT1因在腫瘤形成過程中扮演的重要角色而引起人們的廣泛關(guān)注[11]。SIRT1 屬于煙酰胺(NAD+)依賴的Ⅲ型組蛋白去乙?；竤irtuin家族，哺乳動物sirtuin家族包含7個成員(SIRT1～7)[12]。在sirtuin家族成員中，SIRT1是調(diào)控物質(zhì)代謝、壽命長短以及細胞衰老的重要因子[13]。研究表明SIRT1可通過使腫瘤抑制蛋白P53第382位的賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；饔?，從而降低P53的活性，因此使細胞繞過P53介導(dǎo)的凋亡而繼續(xù)存活[14]。目前，SIRT1在卵巢癌細胞中的作用研究較少。在卵巢癌組織中，有研究表明SIRT1的蛋白表達及去乙?；富钚跃@著增加[15]。而de Jong等[16]發(fā)現(xiàn)一種花生四烯酸代謝物15d-PGJ2能夠通過抑制SIRT1的表達進而誘導(dǎo)卵巢癌細胞A2780凋亡。以上結(jié)果提示SIRT1在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。然而，EGCG是否能夠調(diào)控SIRT1-P53通路？SIRT1-P53信號通路是否參與了EGCG誘導(dǎo)人卵巢癌細胞SKOV-3凋亡的過程？這些問題都需要進一步研究。在本實驗中，我們首次發(fā)現(xiàn)EGCG可劑量依賴性地抑制SKOV-3細胞中SIRT1的去乙?；富钚院偷鞍妆磉_水平，并增加SIRT1下游P53的乙酰化水平。為了進一步明確SIRT1-P53通路在EGCG調(diào)控人卵巢癌SKOV-3細胞增殖和凋亡中的作用，我們給予SKOV-3細胞SIRT1的特異性激動劑SRT1720預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)SRT1720可顯著逆轉(zhuǎn)EGCG對SKOV-3細胞活力和凋亡的影響，進一步的研究表明SRT1720還可拮抗EGCG對SIRT1-P53通路的調(diào)控作用。而單獨給予SIRT1的抑制劑EX527可誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡，抑制SIRT1去乙?；富钚詮亩黾覲53的乙酰化水平。

Figure 4.EGCG regulated the P53 acetylation through SIRT1 inhibition. SKOV-3 cells were treated with 1 μmol/L EX527 or pretreated with 1 μmol/L SRT1720 for 1 h followed by stimulation with EGCG (50 μmol/L) for 24 h. A: SIRT1 deacetylase acti-vity was measured by SIRT1 deacetylase fluorometric assay kit; B: the protein levels of SIRT1, Ac-P53 and P53 were exa-mined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGCG group.

圖4EGCG通過抑制SIRT1調(diào)控P53的乙?；?/p>

綜上所述，本實驗證明SIRT1-P53通路參與了EGCG誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV-3細胞凋亡的病理過程，我們的研究為EGCG在卵巢癌防治中的應(yīng)用提供了必要的實驗資料和理論依據(jù)。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Epigallocatechin gallate induces apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3 via regulation of SIRT1-P53 pathways

YOU Hui-min, KANG Xiang-jin, YANG Jie, LIN Yan-shan, LIU Jian-qiao, DU Hong-zi

(CenterforReproductiveMedicine,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，KeyLaboratoryforReproductiveMedicineofGuangdongProvince,KeyLaboratoryforMajorObstetricDiseasesofGuangdongProvince，KeyLaboratoryofReproductionandGeneticsofGuangdongHigherEducationInstitutes,Guangzhou510150,China.E-mail:hongzidgzmu@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the effect of epigallocatechin gallate (EGCG) on the growth and apoptosis of ova-rian cancer cell line SKOV-3 and its molecular mechanism. METHODS: SKOV-3 cells were treated with different concentrations of EGCG (0～50 μmol/L), SRT1720 (1 μmol/L) or EX527 (1 μmol/L) for 24 h. The cell activity was evaluated by CCK-8 assay. The apoptosis of SKOV-3 cells was analyzed by flow cytometry. The mRNA expression of Bcl-2 and Bax was detected by real-time PCR. SIRT1 deacetylase fluorometric assay kit was used to detect the activity of SIRT1. The protein levels of SIRT1 and acetylated P53 (Ac-P53) were determined by Western blot. RESULTS: EGCG or EX527 decreased the deacetylase activity and protein expression of SIRT1, and increased the level of Ac-P53 in a dose-dependent manner. Moreover, SRT1720 abrogated the effects of EGCG on the activity, apoptosis and SIRT1-P53 pathways in ovarian cancer cell line SKOV-3. CONCLUSION: EGCG inhibits the activity and induces apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3 by regulating SIRT1-P53 pathways.

[KEY WORDS]Epigallocatechin gallate; SKOV-3 cells; Apoptosis; SIRT1-P53 pathway

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0076- 07

[收稿日期]2015- 07- 23[修回日期] 2015- 10- 23

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81401254);廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強省科研項目(No. 20142097)；廣州市教育局市屬高?？蒲许椖?No. 1201430205)

通訊作者△Tel: 020-81292233； E-mail： hongzidgzmu@163.com

[中圖分類號]R730.23； R737.31

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.013