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        重組人骨保護素Fc融合蛋白對骨質(zhì)疏松性骨折早期愈合的影響

        2016-06-29 06:37:41沈業(yè)彤張學斌吳麗紅劉果彤陶敏燕徐鳳琳
        中國老年學雜志 2016年10期
        關(guān)鍵詞:愈合核因子

        沈業(yè)彤 張學斌 吳麗紅 劉果彤 王 琳 陶敏燕 徐鳳琳

        (齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨外科,黑龍江 齊齊哈爾 161041)

        重組人骨保護素Fc融合蛋白對骨質(zhì)疏松性骨折早期愈合的影響

        沈業(yè)彤張學斌吳麗紅劉果彤王琳陶敏燕徐鳳琳

        (齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨外科,黑龍江齊齊哈爾161041)

        〔摘要〕目的通過對去勢的骨質(zhì)疏松(OP)大鼠股骨骨折模型局部應用重組人骨保護素 Fc 融合蛋白(OPG-Fc),探討調(diào)節(jié)骨保護素(OPG)和核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達變化對OP性骨折早期愈合的影響。方法以去勢方法建立OP雌性SD大鼠模型,選擇75只OP大鼠隨機分成實驗組、對照組及假手術(shù)組,每組25只。建立大鼠股骨骨折模型,實驗組骨折局部注射OPG-Fc,對照組骨折局部注射生理鹽水,假手術(shù)組單純切開至股骨后縫合,不形成骨折,于術(shù)后第7天、第14天、第28天、第42天、第56天5個時間節(jié)段分批行心臟采血并處死模型,血清標本行血清堿性磷酸酶(ALP)的分光光度法測定;股骨骨折處標本切片后通過HE染色觀察骨折愈合情況,免疫組織化學染色分析破骨細胞數(shù)量變化情況;分別于第28天及第56天測定各組骨密度(BMD)將各組測得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果大體標本HE染色實驗組骨痂形成及改造較對照組提前,對照組骨折愈合明顯遲延,免疫組織化學染色顯示在第7天、第14天、第28天各個時間節(jié)段實驗組破骨細胞計數(shù)值均低于對照組(P<0.05);ALP血清濃度在假手術(shù)組各個時間點波幅很小,對照組濃度于術(shù)后第14天開始升高,至第28天至高峰,隨后漸降,實驗組大鼠ALP 血清濃度變化規(guī)律與對照組的變化相似,但在第14和28天時數(shù)值增高明顯(P<0.05),第42天及第56天實驗組和對照組破骨細胞計數(shù)值及ALP濃度值均趨同,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);BMD在第28天和第56天時對照組明顯低于實驗組(P<0.05)。結(jié)論OPG-Fc具有成骨活性增高與破骨活性降低的雙重作用,促進骨折愈合,尤其在OP性骨折早期治療中具有重要意義。

        〔關(guān)鍵詞〕骨質(zhì)疏松性骨折;愈合;骨保護素Fc融合蛋白;核因子-κB受體活化因子配體

        骨質(zhì)疏松性骨折(OPF)不僅發(fā)病率高,病殘率、死亡率及平均醫(yī)療支出費用均較普通創(chuàng)傷性骨折顯著增高〔1〕,在OPF愈合過程中,成骨細胞和軟骨細胞功能狀態(tài)低下,導致骨皮質(zhì)薄、骨痂少、生物力學性能下降,而易發(fā)生內(nèi)固定物失效及再骨折等嚴重并發(fā)癥。以往研究大多側(cè)重于OPF后期如何增加骨密度(BMD)方向,很少有針對骨折愈合早期階段在微觀水平上進行相關(guān)研究。傳統(tǒng)的抗骨質(zhì)疏松(OP)藥物主要分三類:抗骨吸收類藥物、促骨形成類藥物和骨鈣化類藥物〔2~4〕。目前諸多學者認為,許多細胞因子、激素等影響因素均可通過骨保護素(OPG)的競爭機制來調(diào)節(jié)核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達,從而調(diào)控OPG、RANKL和核因子-κB受體活化因子(RANK)之間的比值,直接對破骨細胞的分化和功能產(chǎn)生決定性作用,來調(diào)節(jié)破骨細胞的活性及凋亡過程,并且OPG在軟骨內(nèi)成骨過程中也有著重要的促進作用,這種既抗骨吸收又促骨形成的雙重作用,為OPF的治療開辟了一條新途徑,本文探討重組人骨保護素Fc融合蛋白(OPG-Fc)對OPF早期愈合的影響。

        1材料和方法

        1.1實驗動物和試劑重組人OPG-Fc劑型(50 μg/支)、二甲苯溶液、蜂蠟、酒精溶液、蘇木精染液、石蠟溶液、1%鹽酸乙醇、1%伊紅酒精溶液、樹膠等。 TRAP 免疫組化染色試劑盒。堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒。健康雌性3個月齡SD大鼠75只,體重265~310 g,由齊齊哈爾醫(yī)學院動物實驗研究室提供。

        1.2動物分組和模型選擇75只大鼠行去勢手術(shù),備皮后以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉,于下腹中部切開皮膚,逐層鈍性分離腹肌、打開腹膜,探查卵巢并結(jié)扎后摘除,縫合切口,術(shù)前及術(shù)后肌注慶大霉素一次預防感染。飼養(yǎng)于溫度20℃~25℃、濕度60%~70%環(huán)境中,食、水適量,8 w后經(jīng)骨密度(BMD)儀檢測篩選,將造模成功大鼠75只隨機分組,分為實驗組、對照組、假手術(shù)組,每組25只并標記。以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉,備皮后取右大腿外側(cè)切口,鈍性分離至股骨干,經(jīng)股骨中段(大轉(zhuǎn)子下1.5 cm處)以直徑1.0 mm牙科鉆鉆過,縱向形成規(guī)整的3 mm×1 mm不完全骨折,保持兩側(cè)骨質(zhì)完好,并有足夠強度不形成完全骨折,縫合后對照組局部注射1 ml生理鹽水,實驗組將重組人OPG-Fc融合蛋白50 μg溶入10 ml注射用水中,即濃度為5 μg/ml,并以1 ml局部注射,假手術(shù)組單純切開至股骨表面,不形成骨折,直接縫合。術(shù)前及術(shù)后兩組大鼠均肌注慶大霉素一次預防感染,淘汰失敗模型,并補充,保持數(shù)目不變。

        1.3標本采集和處理三組動物于術(shù)后第7天、第14天、第28天、第42天、第56天5個時間節(jié)段分批行心臟采血并處死模型,血清標本行血清ALP的分光光度法測定(金氏單位/100 μl);實驗組和對照組股骨骨折處標本切片后通過HE染色觀察骨折愈合情況,免疫組織化學染色分析破骨細胞數(shù)量變化情況。

        1.4觀察指標

        1.4.1HE染色制好的切片經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染核、鹽酸及酒精分化、伊紅染漿、再脫水透明,最后以中性樹膠封片,在光鏡下觀察其骨痂生長情況及其組織形態(tài)。

        1.4.2免疫組化染色將切片脫蠟復水,首先孵育液 A 液:0.2 mol/L 醋酸緩沖液8 ml;再孵育液B液:取六耦氮副品紅1 ml;再孵育液C液:在1 ml N,N-二甲基甲酰胺中溶解20 mg萘酚AS-BI 磷酸酯。然后將 A、B 液按比例混和,并將pH值調(diào)到5.0,加入C液,最后將141 mg酒石酸鉀鈉加入。破骨細胞固定后,切片浸入孵育液內(nèi),封片。鏡下觀察破骨細胞數(shù)量。

        1.4.3BMD檢測實驗組和對照組分別于第28天及第56天雙能X線骨密度測定儀測定。

        1.5數(shù)據(jù)收集與處理將染色后的切片在光學顯微鏡400倍鏡頭下觀察,并計數(shù)TRAP 陽性染色的破骨細胞。在顯微鏡下,染色陽性的破骨細胞胞質(zhì)呈酒紅色,將這兩張切片中的破骨細胞數(shù)量分別計數(shù)。選擇染色明、分布均的部位進行破骨細胞計數(shù),計數(shù)10 個高倍視野下的破骨細胞細胞總數(shù)為值,即該張切片的破骨細胞數(shù)。樣本的數(shù)值為兩張切片的破骨細胞總數(shù)的平均數(shù)。統(tǒng)計血清標本行血清ALP及BMD數(shù)據(jù)。

        1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS11.0軟件行t檢驗。

        2結(jié)果

        2.1骨痂組織形態(tài)觀察HE染色切片光鏡下觀察結(jié)果:術(shù)后14 d時兩組纖維骨痂逐漸向軟骨性骨痂轉(zhuǎn)變,開始有原始小梁狀骨出現(xiàn)。但實驗組原始小梁狀骨多,并表面有數(shù)目較多的成骨細胞排列,較多膠原生成,對照組則原始小梁狀骨少,且成骨細胞及膠原較少;骨折后42 d時兩組均有編織骨出現(xiàn),原始小梁狀骨內(nèi)軟骨細胞凋亡或成軟骨島,實驗組成熟骨小梁較多且有大量類骨質(zhì)形成,對照組骨痂相對較少,軟骨成骨慢,骨小梁粗細不均、紊亂;第56天時實驗組皮質(zhì)骨生成量明顯多于對照組,對照組骨小梁鈣化不全明顯,顯示愈合滯后。見圖1。

        2.2光學顯微鏡下對破骨細胞觀察并計數(shù)將實驗組和對照組所計數(shù)的破骨細胞個數(shù)取平均值,得出7 d、14 d、28 d、42 d的兩組中每個樣本的破骨細胞個數(shù)的平均數(shù),實驗組分別為2.953±0.064、1.652±0.151、3.817±0.064、7.538±0.082,對照組分別為5.142±0.043、7.613±0.056、5.331±0.082、7.241±0.061。在第7天、14天、28天時兩組破骨細胞平均數(shù)差異顯著(P<0.05)。見圖2。

        圖1 42 d時骨癡組織形態(tài)觀察(HE,×400)

        圖2 7 d時兩組破骨細胞觀察(HE,×400)

        2.3術(shù)后不同時間各組血清中 ALP的變化情況ALP血清濃度在假手術(shù)組各個時間點波幅很小,對照組濃度于術(shù)后第14天開始升高,至第28天至高峰,隨后漸降,實驗組大鼠ALP 血清濃度變化規(guī)律與對照組的變化相似,但在第14天和第28 天時數(shù)值增高明顯(P<0.05),第42天及第56天實驗組和對照組ALP濃度值趨同,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

        表1 各組骨折后不同時間節(jié)段血清中ALP濃度變化

        與對照組比較:1)P<0.05

        2.4各時點各組BMD水平第28天和第56天時實驗組BMD分別為(0.191±0.042)g/mm2、(0.185± 0.097)g/mm2;對照組分別為(0.184±0.014)g/mm2、(0.173±0.015)g/mm2,兩個時間段對照組明顯低于實驗組(P<0.05)。

        3討論

        OP發(fā)病是一個逐漸的緩慢的過程,在微觀結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)骨小梁的萎縮,骨量的減少,骨支架功能的減退,而易出現(xiàn)骨折,常以椎體、髖部和前臂骨折多見,特別在絕經(jīng)后婦女人群中最常見〔5〕。由于骨折的修復重建是一個慢性的過程,所以本實驗選擇的時間點以2 w為間隔,但考慮到第1周時,骨折早期變化比較典型,故增加7 d為考察點,而BMD變化周期長,故僅選擇第28天、56天兩個時間點比較,這樣選擇,既可以收集到典型的數(shù)據(jù)進行觀察,也可以排除雜亂的干擾因素。

        RANKL/RANK/OPG環(huán)路系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來,被認為是體內(nèi)諸多因子調(diào)控破骨細胞功能的主要途徑〔6〕。其機制大致如下,RANKL為破骨細胞生長及分化所必需的細胞因子〔7〕,它通過與RNAK結(jié)合使破骨細胞活性增強,達到骨吸收加強的效果,OPG是RANKL的誘騙受體,通過競爭性抑制作用,可以減少RANKL與RNAK結(jié)合,從而抑制破骨細胞分化、成熟,并且成熟破骨細胞活性也受到抑制〔8,9〕。OPG還可以激發(fā)成骨活性,通過促進成骨細胞樣細胞分化成熟為成骨細胞的途徑來實現(xiàn)成骨作用,進而促進新骨組織形成〔10〕?,F(xiàn)諸多實驗證明,破骨細胞表面的RANK是RANKL的唯一受體,成骨細胞分泌OPG,競爭性地抑制了RANKL與RANK結(jié)合,從而抑制了破骨細胞的生物活性及其成熟。骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs、前列腺素(PG)E2、甲狀旁腺激素(PTH)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β、雌激素、糖皮質(zhì)激素等對破骨細胞的抑制作用均是通過調(diào)節(jié)該通路表達而完成的,但關(guān)于該通路對促進成骨作用的研究及實驗卻少有報道。

        本實驗應用OPG-Fc可排除其他因素,達到直接使OPG/RANKL比值增大,下調(diào)RANKL表達的目的,與應用腺病毒改變基因表達效果相同,以往實驗顯示該蛋白藥效為局部作用,半衰期約6~7 d,藥物性能持續(xù)約30 d,可完全滿足本實驗要求,也是28 d后實驗組和對照組破骨細胞計數(shù)值及ALP濃度值均趨同的原因之一,但這并不影響OPG-Fc對OPF愈合早期影響的觀察結(jié)果。本文結(jié)果顯示OPG-Fc能明顯抑制破骨細胞活性,抑制早期骨折端骨質(zhì)的吸收,打破骨生成與骨吸收的動態(tài)平衡,使骨痂明顯增多,并可促進骨成熟加速,減少骨吸收,提高BMD,28 d后隨著藥效的減低,對骨折后期骨痂的塑形改造并不會產(chǎn)生嚴重影響。ALP血清含量作為成骨活動強弱的指標之一,本實驗說明OPG-Fc不但能抑制破骨細胞的活性,還具有增強成骨細胞活性的雙重作用,從而增加了新生骨痂,提升BMD和骨質(zhì)生物力學強度,起到促進OPF的愈合的作用。

        有研究通過組織學與生物力學指標的觀察發(fā)現(xiàn)OP對大鼠骨折愈合早期(術(shù)后3 w)即有不利影響〔11〕,本實驗通過對OPF的大鼠模型應用OPG-Fc,著重研究其對OPF愈合早期的影響,故在藥物失去效力(約30 d)后,并未重復給藥,所以對骨折愈合的后期情況缺乏觀察比較,尤其在鈣沉積和骨再塑方面有待于進一步研究探討。

        4參考文獻

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        〔2016-03-01修回〕

        (編輯曹夢園)

        基金項目:黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目(No.12541920)

        〔中圖分類號〕R683.42

        〔文獻標識碼〕A

        〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2327-03;

        doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.007

        第一作者:沈業(yè)彤(1975-),男,副主任醫(yī)師,碩士,主要從事骨關(guān)節(jié)創(chuàng)傷修復關(guān)節(jié)置換研究。

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