沈業(yè)彤　張學斌　吳麗紅　劉果彤　王　琳　陶敏燕　徐鳳琳

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨外科，黑龍江　齊齊哈爾　161041)

重組人骨保護素Fc融合蛋白對骨質(zhì)疏松性骨折早期愈合的影響

沈業(yè)彤張學斌吳麗紅劉果彤王琳陶敏燕徐鳳琳

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨外科，黑龍江齊齊哈爾161041)

〔摘要〕目的通過對去勢的骨質(zhì)疏松(OP)大鼠股骨骨折模型局部應用重組人骨保護素 Fc 融合蛋白(OPG-Fc)，探討調(diào)節(jié)骨保護素(OPG)和核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達變化對OP性骨折早期愈合的影響。方法以去勢方法建立OP雌性SD大鼠模型，選擇75只OP大鼠隨機分成實驗組、對照組及假手術(shù)組,每組25只。建立大鼠股骨骨折模型,實驗組骨折局部注射OPG-Fc，對照組骨折局部注射生理鹽水，假手術(shù)組單純切開至股骨后縫合，不形成骨折，于術(shù)后第7天、第14天、第28天、第42天、第56天5個時間節(jié)段分批行心臟采血并處死模型,血清標本行血清堿性磷酸酶(ALP)的分光光度法測定；股骨骨折處標本切片后通過HE染色觀察骨折愈合情況,免疫組織化學染色分析破骨細胞數(shù)量變化情況；分別于第28天及第56天測定各組骨密度(BMD)將各組測得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果大體標本HE染色實驗組骨痂形成及改造較對照組提前,對照組骨折愈合明顯遲延，免疫組織化學染色顯示在第7天、第14天、第28天各個時間節(jié)段實驗組破骨細胞計數(shù)值均低于對照組(P<0.05)；ALP血清濃度在假手術(shù)組各個時間點波幅很小，對照組濃度于術(shù)后第14天開始升高，至第28天至高峰，隨后漸降，實驗組大鼠ALP 血清濃度變化規(guī)律與對照組的變化相似，但在第14和28天時數(shù)值增高明顯(P<0.05)，第42天及第56天實驗組和對照組破骨細胞計數(shù)值及ALP濃度值均趨同，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；BMD在第28天和第56天時對照組明顯低于實驗組(P<0.05)。結(jié)論OPG-Fc具有成骨活性增高與破骨活性降低的雙重作用，促進骨折愈合，尤其在OP性骨折早期治療中具有重要意義。

〔關(guān)鍵詞〕骨質(zhì)疏松性骨折；愈合；骨保護素Fc融合蛋白；核因子-κB受體活化因子配體

骨質(zhì)疏松性骨折(OPF)不僅發(fā)病率高，病殘率、死亡率及平均醫(yī)療支出費用均較普通創(chuàng)傷性骨折顯著增高〔1〕，在OPF愈合過程中，成骨細胞和軟骨細胞功能狀態(tài)低下，導致骨皮質(zhì)薄、骨痂少、生物力學性能下降，而易發(fā)生內(nèi)固定物失效及再骨折等嚴重并發(fā)癥。以往研究大多側(cè)重于OPF后期如何增加骨密度(BMD)方向，很少有針對骨折愈合早期階段在微觀水平上進行相關(guān)研究。傳統(tǒng)的抗骨質(zhì)疏松(OP)藥物主要分三類：抗骨吸收類藥物、促骨形成類藥物和骨鈣化類藥物〔2～4〕。目前諸多學者認為，許多細胞因子、激素等影響因素均可通過骨保護素(OPG)的競爭機制來調(diào)節(jié)核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達,從而調(diào)控OPG、RANKL和核因子-κB受體活化因子(RANK)之間的比值,直接對破骨細胞的分化和功能產(chǎn)生決定性作用，來調(diào)節(jié)破骨細胞的活性及凋亡過程，并且OPG在軟骨內(nèi)成骨過程中也有著重要的促進作用，這種既抗骨吸收又促骨形成的雙重作用，為OPF的治療開辟了一條新途徑，本文探討重組人骨保護素Fc融合蛋白(OPG-Fc)對OPF早期愈合的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物和試劑重組人OPG-Fc劑型(50 μg/支)、二甲苯溶液、蜂蠟、酒精溶液、蘇木精染液、石蠟溶液、1%鹽酸乙醇、1%伊紅酒精溶液、樹膠等。 TRAP 免疫組化染色試劑盒。堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒。健康雌性3個月齡SD大鼠75只,體重265～310 g,由齊齊哈爾醫(yī)學院動物實驗研究室提供。

1.2動物分組和模型選擇75只大鼠行去勢手術(shù)，備皮后以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，于下腹中部切開皮膚，逐層鈍性分離腹肌、打開腹膜，探查卵巢并結(jié)扎后摘除，縫合切口，術(shù)前及術(shù)后肌注慶大霉素一次預防感染。飼養(yǎng)于溫度20℃～25℃、濕度60%～70%環(huán)境中，食、水適量，8 w后經(jīng)骨密度(BMD)儀檢測篩選，將造模成功大鼠75只隨機分組，分為實驗組、對照組、假手術(shù)組，每組25只并標記。以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，備皮后取右大腿外側(cè)切口,鈍性分離至股骨干,經(jīng)股骨中段(大轉(zhuǎn)子下1.5 cm處)以直徑1.0 mm牙科鉆鉆過，縱向形成規(guī)整的3 mm×1 mm不完全骨折，保持兩側(cè)骨質(zhì)完好，并有足夠強度不形成完全骨折，縫合后對照組局部注射1 ml生理鹽水，實驗組將重組人OPG-Fc融合蛋白50 μg溶入10 ml注射用水中，即濃度為5 μg/ml,并以1 ml局部注射，假手術(shù)組單純切開至股骨表面，不形成骨折，直接縫合。術(shù)前及術(shù)后兩組大鼠均肌注慶大霉素一次預防感染，淘汰失敗模型，并補充，保持數(shù)目不變。

1.3標本采集和處理三組動物于術(shù)后第7天、第14天、第28天、第42天、第56天5個時間節(jié)段分批行心臟采血并處死模型,血清標本行血清ALP的分光光度法測定(金氏單位/100 μl)；實驗組和對照組股骨骨折處標本切片后通過HE染色觀察骨折愈合情況,免疫組織化學染色分析破骨細胞數(shù)量變化情況。

1.4觀察指標

1.4.1HE染色制好的切片經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染核、鹽酸及酒精分化、伊紅染漿、再脫水透明,最后以中性樹膠封片,在光鏡下觀察其骨痂生長情況及其組織形態(tài)。

1.4.2免疫組化染色將切片脫蠟復水,首先孵育液 A 液：0.2 mol/L 醋酸緩沖液8 ml；再孵育液B液：取六耦氮副品紅1 ml；再孵育液C液：在1 ml N,N-二甲基甲酰胺中溶解20 mg萘酚AS-BI 磷酸酯。然后將 A、B 液按比例混和，并將pH值調(diào)到5.0，加入C液，最后將141 mg酒石酸鉀鈉加入。破骨細胞固定后，切片浸入孵育液內(nèi)，封片。鏡下觀察破骨細胞數(shù)量。

1.4.3BMD檢測實驗組和對照組分別于第28天及第56天雙能X線骨密度測定儀測定。

1.5數(shù)據(jù)收集與處理將染色后的切片在光學顯微鏡400倍鏡頭下觀察，并計數(shù)TRAP 陽性染色的破骨細胞。在顯微鏡下，染色陽性的破骨細胞胞質(zhì)呈酒紅色，將這兩張切片中的破骨細胞數(shù)量分別計數(shù)。選擇染色明、分布均的部位進行破骨細胞計數(shù)，計數(shù)10 個高倍視野下的破骨細胞細胞總數(shù)為值，即該張切片的破骨細胞數(shù)。樣本的數(shù)值為兩張切片的破骨細胞總數(shù)的平均數(shù)。統(tǒng)計血清標本行血清ALP及BMD數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS11.0軟件行t檢驗。

2結(jié)果

2.1骨痂組織形態(tài)觀察HE染色切片光鏡下觀察結(jié)果：術(shù)后14 d時兩組纖維骨痂逐漸向軟骨性骨痂轉(zhuǎn)變，開始有原始小梁狀骨出現(xiàn)。但實驗組原始小梁狀骨多，并表面有數(shù)目較多的成骨細胞排列，較多膠原生成，對照組則原始小梁狀骨少，且成骨細胞及膠原較少；骨折后42 d時兩組均有編織骨出現(xiàn)，原始小梁狀骨內(nèi)軟骨細胞凋亡或成軟骨島，實驗組成熟骨小梁較多且有大量類骨質(zhì)形成，對照組骨痂相對較少，軟骨成骨慢，骨小梁粗細不均、紊亂；第56天時實驗組皮質(zhì)骨生成量明顯多于對照組，對照組骨小梁鈣化不全明顯，顯示愈合滯后。見圖1。

2.2光學顯微鏡下對破骨細胞觀察并計數(shù)將實驗組和對照組所計數(shù)的破骨細胞個數(shù)取平均值，得出7 d、14 d、28 d、42 d的兩組中每個樣本的破骨細胞個數(shù)的平均數(shù)，實驗組分別為2.953±0.064、1.652±0.151、3.817±0.064、7.538±0.082,對照組分別為5.142±0.043、7.613±0.056、5.331±0.082、7.241±0.061。在第7天、14天、28天時兩組破骨細胞平均數(shù)差異顯著(P<0.05)。見圖2。

圖1　42 d時骨癡組織形態(tài)觀察(HE，×400)

圖2　7 d時兩組破骨細胞觀察(HE，×400)

2.3術(shù)后不同時間各組血清中 ALP的變化情況ALP血清濃度在假手術(shù)組各個時間點波幅很小，對照組濃度于術(shù)后第14天開始升高，至第28天至高峰，隨后漸降，實驗組大鼠ALP 血清濃度變化規(guī)律與對照組的變化相似，但在第14天和第28 天時數(shù)值增高明顯(P<0.05)，第42天及第56天實驗組和對照組ALP濃度值趨同，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　各組骨折后不同時間節(jié)段血清中ALP濃度變化

與對照組比較：1)P<0.05

2.4各時點各組BMD水平第28天和第56天時實驗組BMD分別為(0.191±0.042)g/mm2、(0.185± 0.097)g/mm2；對照組分別為(0.184±0.014)g/mm2、(0.173±0.015)g/mm2，兩個時間段對照組明顯低于實驗組(P<0.05)。

3討論

OP發(fā)病是一個逐漸的緩慢的過程，在微觀結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)骨小梁的萎縮，骨量的減少，骨支架功能的減退，而易出現(xiàn)骨折，常以椎體、髖部和前臂骨折多見，特別在絕經(jīng)后婦女人群中最常見〔5〕。由于骨折的修復重建是一個慢性的過程，所以本實驗選擇的時間點以2 w為間隔，但考慮到第1周時，骨折早期變化比較典型，故增加7 d為考察點，而BMD變化周期長，故僅選擇第28天、56天兩個時間點比較，這樣選擇，既可以收集到典型的數(shù)據(jù)進行觀察，也可以排除雜亂的干擾因素。

RANKL/RANK/OPG環(huán)路系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來，被認為是體內(nèi)諸多因子調(diào)控破骨細胞功能的主要途徑〔6〕。其機制大致如下，RANKL為破骨細胞生長及分化所必需的細胞因子〔7〕,它通過與RNAK結(jié)合使破骨細胞活性增強,達到骨吸收加強的效果，OPG是RANKL的誘騙受體,通過競爭性抑制作用，可以減少RANKL與RNAK結(jié)合，從而抑制破骨細胞分化、成熟，并且成熟破骨細胞活性也受到抑制〔8，9〕。OPG還可以激發(fā)成骨活性，通過促進成骨細胞樣細胞分化成熟為成骨細胞的途徑來實現(xiàn)成骨作用,進而促進新骨組織形成〔10〕?，F(xiàn)諸多實驗證明，破骨細胞表面的RANK是RANKL的唯一受體，成骨細胞分泌OPG，競爭性地抑制了RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制了破骨細胞的生物活性及其成熟。骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs、前列腺素(PG)E2、甲狀旁腺激素(PTH)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β、雌激素、糖皮質(zhì)激素等對破骨細胞的抑制作用均是通過調(diào)節(jié)該通路表達而完成的，但關(guān)于該通路對促進成骨作用的研究及實驗卻少有報道。

本實驗應用OPG-Fc可排除其他因素，達到直接使OPG/RANKL比值增大，下調(diào)RANKL表達的目的，與應用腺病毒改變基因表達效果相同，以往實驗顯示該蛋白藥效為局部作用，半衰期約6～7 d，藥物性能持續(xù)約30 d，可完全滿足本實驗要求，也是28 d后實驗組和對照組破骨細胞計數(shù)值及ALP濃度值均趨同的原因之一，但這并不影響OPG-Fc對OPF愈合早期影響的觀察結(jié)果。本文結(jié)果顯示OPG-Fc能明顯抑制破骨細胞活性，抑制早期骨折端骨質(zhì)的吸收，打破骨生成與骨吸收的動態(tài)平衡，使骨痂明顯增多，并可促進骨成熟加速，減少骨吸收，提高BMD，28 d后隨著藥效的減低，對骨折后期骨痂的塑形改造并不會產(chǎn)生嚴重影響。ALP血清含量作為成骨活動強弱的指標之一，本實驗說明OPG-Fc不但能抑制破骨細胞的活性，還具有增強成骨細胞活性的雙重作用，從而增加了新生骨痂，提升BMD和骨質(zhì)生物力學強度，起到促進OPF的愈合的作用。

有研究通過組織學與生物力學指標的觀察發(fā)現(xiàn)OP對大鼠骨折愈合早期(術(shù)后3 w)即有不利影響〔11〕，本實驗通過對OPF的大鼠模型應用OPG-Fc，著重研究其對OPF愈合早期的影響，故在藥物失去效力(約30 d)后，并未重復給藥，所以對骨折愈合的后期情況缺乏觀察比較，尤其在鈣沉積和骨再塑方面有待于進一步研究探討。

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〔2016-03-01修回〕

(編輯曹夢園)

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目(No.12541920)

〔中圖分類號〕R683.42

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2327-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.007

第一作者：沈業(yè)彤(1975-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事骨關(guān)節(jié)創(chuàng)傷修復關(guān)節(jié)置換研究。