葛建彬+盧紅建+宋新建+李梅+陳丹丹+吳鋒

[摘要]探討枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）對缺血再灌腦損傷小鼠的保護作用及其可能的機制。采用頸總動脈栓線造成大腦中動脈缺血，缺血2 h后將栓線拔出以實現(xiàn)大腦中動脈血流再灌注，形成小鼠短暫性大腦中動脈阻塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型，觀察LBP（25，50，100 mg·kg-1）對小鼠腦梗死范圍，腦含水量，神經(jīng)癥狀的影響；采用HE染色觀察LBP對小鼠腦組織神經(jīng)細胞的影響，Western blot法檢測缺血大腦皮層NFκB p65蛋白的表達，ELISA法檢測血清中TNFα，IL6和IL1β的水平。結(jié)果顯示，LBP對缺血再灌注小鼠神經(jīng)癥狀有明顯的改善作用，能明顯降低腦梗死范圍和腦含水量。腦組織病理切片也證實了LBP對神經(jīng)細胞的保護作用。Western blot結(jié)果顯示，小鼠缺血再灌后缺血側(cè)大腦皮層p65蛋白水平明顯增高，LBP能顯著降低p65蛋白水平。ELISA結(jié)果顯示，LBP能顯著降低缺血再灌后TNFα，IL6和IL1β的生成。表明LBP對缺血再灌注小鼠腦損傷有明顯保護作用，該作用可能與其抑制NFκB和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]枸杞多糖； 腦缺血； 核因子κB； 腫瘤壞死因子α； 白細胞介素6； 白細胞介素1β

Protective effects of LBP on cerebral ischemia reperfusion injury in mice and

mechanism of inhibiting NFκB， TNFα， IL6 and IL1β

GE Jianbin1，2， LU Hongjian1， SONG Xinjian1， LI Mei2， CHEN Dandan3， WU Feng3*

（1 The Second People′s Hospital of Nantong， Nantong 226002， China；

2 Department of Pharmacology， College of Pharmaceutical Science， Soochow University， Suzhou 215123， China；

3 Department of Pharmacology， Nantong University， Nantong 226001，China）

[Abstract]To observe the protective effects of Lycium barbarum polysaccharides （LBP） on cerebral ischemia reperfusion injury in mice and explore its mechanism Common carotid artery thread was used to cause middle cerebral artery ischemia， and the thread was taken out after 2 h ischemia to achieve cerebral ischemia reperfusion injury in mice Therefore， the transient middle cerebral artery occlusion （tMCAO） models were established to observe the effects of LBP （25，50， 100 mg·kg-1） on neurological outcome， infarct size and water contents HE staining was used to observe its effects on neurocytes of cerebral tissues in mice Western blotting was used to evaluate the protein expression levels of NFκB p65 ELISA was used to evaluate the levels of TNFα， IL6 and IL1β in the serum According to the results， LBP markedly improved neurologic deficits， and decreased infarct size and water contents at 24 h after reperfusion in mice Pathological section of brain tissues also proved its protective effects on neurocytes Western blot analysis indicated that LBP markedly downregulated the protein level of NFκB p65 ELISA indicated that LBP decreased the levels of TNFα， IL6 and IL1β in the serum 24 h after reperfusionIn conclusion， LBP has protective effects on cerebral ischemia reperfusion injury in mice， and this effect may be associated with inhibiting NFκB and inflammatory reactions

[Key words]LBP； cerebral ischemia； nuclear factor κB； tumor necrosis factorα； interleukin6； interleukin1β

腦梗死是臨床常見病和多發(fā)病，具有極高的病死率和致殘率，其病理機制復(fù)雜，目前臨床治療效果不理想。腦梗死后一段時間缺血區(qū)域局部血流恢復(fù)，形成再灌注損傷，與再灌注有關(guān)的急性炎癥反應(yīng)促進了繼發(fā)性腦損害的發(fā)展[1]。研究表明，NFκB是與缺血損傷密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，NFκB活化后可促進多種炎性細胞因子的表達，從而加重腦損傷。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是從茄科植物枸杞的成熟果實中提取而得的一種水溶性蛋白雜多糖，具有多種藥理作用[2]。最近Gao等[3]的研究表明，LBP通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元的凋亡和再生，從而提高腦外傷大鼠的認知能力；Yang等[4]亦報道，LBP通過保護血腦屏障對腦缺血再灌注引起的腦損傷產(chǎn)生保護作用，提示LBP在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中可能發(fā)揮重要作用。本實驗采用線栓法建立小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察LBP對腦缺血再灌注損傷的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1材料

11動物健康6周齡ICR小鼠，清潔級，雄性，體重20～25 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。

12藥物與試劑枸杞多糖（LBP，寧夏沃福百瑞生物食品工程有限公司）；尼莫地平注射液（拜耳醫(yī)藥）；2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；NFκB p65（Cell Signaling Technology公司）；βactin（Sigma公司）；TNFα，IL6 和 IL1β試劑盒（美國ADL公司）。

13儀器SZM45體視顯微鏡（寧波舜宇）；AL104電子天平（MettlerToledo公司）；Elx800酶標儀（Biotek公司）；超聲細胞破碎儀（Sonics & Meterials 公司）；蛋白定量儀（Biorad公司）；power PAC 2000電泳儀（Biorad公司）；MicroCL 21R離心機（Thermo Scientific，德國）。

2方法

21分組將實驗小鼠隨機分為6組，每組30只，分別為假手術(shù)組、MCAO模型組、LBP高劑量組（100 mg·kg-1）、LBP中劑量組（50 mg·kg-1）、LBP低劑量組（25 mg·kg-1）和尼莫地平組（4 mg·kg-1）組。各組動物腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)7 d，末次給藥1 h后進行手術(shù)。假手術(shù)組和模型組每次注射等量生理鹽水，其余實驗步驟與LBP干預(yù)組相同。

22小鼠腦缺血再灌注損傷（MCAO）模型的制備參考Longa等[5]的方法，制備小鼠腦缺血再灌注模型：用4%水合氯醛（350 mg·kg-1）將小鼠腹腔注射麻醉，仰臥位固定，注意保持呼吸通暢。乙醇棉球頸部消毒，用手術(shù)剪沿頸中打開1 cm左右的切口。在體視顯微鏡下鈍性分離下頜下腺，游離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，頸總動脈上用一絲線扎緊。在頸外動脈與頸總動脈分叉處用絲線打一松結(jié)，將頸外動脈遠端用絲線結(jié)扎，用電凝筆將頸外動脈熔斷游離；用絲線將頸內(nèi)動脈扎緊，用顯微眼科手術(shù)剪刀將頸外動脈剪一小孔，將線栓通過小孔向下插入至頸外動脈，松開頸內(nèi)動脈上的線結(jié)，將線栓緩慢向頸內(nèi)動脈方向插入，直至感到阻力時即止，為防止出血，將頸外動脈上線結(jié)扎緊。頸部傷口常規(guī)縫合。缺血2 h后，將線栓拔出，使動脈血重新流通24 h。假手術(shù)組手術(shù)步驟同前，不插入線栓。術(shù)后將動物置于室溫25～28 ℃，自由飲水、進食。

23神經(jīng)癥狀評分小鼠腦缺血再灌注后24 h，采用Longa （0～4分）5分制[5]對小鼠的神經(jīng)功能缺損進行評分，0分：活動正常，無神經(jīng)功能障礙者；1分：左前肢不能完全伸直；2分：爬行時向左轉(zhuǎn)圈者；3分：爬行時向左側(cè)傾倒；4分：意識喪失，不能行走者。

24腦梗死體積的測定小鼠腦缺血再灌注后24 h，斷頭取腦，迅速置于-20 ℃冰箱中冷凍20 min后取出，去除嗅球、小腦和低位腦干，在操作臺上將腦組織由前向后行20 mm厚的連續(xù)5片冠狀切片，將腦片置于1%的TTC（1 mol·L-1 KH2PO4 01 mL）磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光溫浴30 min。用掃描儀按順序掃描染色后的腦片，采用計算機軟件系統(tǒng)測量腦梗死面積，并計算腦梗死區(qū)占大腦總體積的百分比。

25腦含水量測定小鼠腦缺血再灌注后24 h，快速斷頭取腦，稱取左右大腦半球濕重，置于電熱恒溫干燥箱中110～115 ℃烘烤至恒重，稱取干重。計算腦含水量，計算公式為：含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

26蘇木素伊紅（HE）染色小鼠腦缺血再灌注后24 h，心臟灌流，斷頭取腦，4 ℃下置于4%多聚甲醛中過夜，后置于20%～30%蔗糖溶液中至組織塊沉底。依次脫水、透明、浸蠟及包埋，用冰凍切片機切片，厚度為8 μm，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。HE染色時將玻片浸泡于二甲苯及不同濃度的乙醇之后水洗，于蘇木素中浸泡5 min，伊紅中浸泡2 min，逐級乙醇脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，攝片。

27Western blotting檢測將取好的小鼠大腦缺血側(cè)皮層組織置于08 mL細胞裂解液中，低溫下超聲勻漿。離心機中12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，分取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ∩鲜鎏幚磉^的1 μL溶液，采用BCA法測定各組蛋白含量，用配制好的細胞裂解液按比例調(diào)整蛋白濃度。樣品中加入上樣緩沖液，混合均勻后于95 ℃變性處理5 min。上樣，安排βactin參照，SDSPAGE電泳，電壓110 V，分離蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，取出凝膠置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡，凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST溶液洗膜，常溫封閉1 h。封閉結(jié)束后，TBST溶液洗膜，將膜放入塑料袋中，按01 mL·cm-2加入一抗溶液（p65，βactin，1∶1 000，5%脫脂牛奶溶液），混勻后將塑料袋中的氣泡去除，用封膜機封口，置于4 ℃中過夜。次日取出硝酸纖維素膜，用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。在膜上加入熒光二抗（1∶2萬，用5%脫脂牛奶稀釋），室溫下雜交爐中輕輕振蕩l h，取出膜，PBS溶液中洗膜3次，每次10 min。用Odyssey Western blot機器掃描獲取Western條帶圖片。

28ELISA檢測血清TNFα，IL6和IL1β的水平小鼠腦缺血再灌注后24 h，腹主動脈取血6 mL，室溫靜置4 h后離心（3 000 r·min-1，5 min）。取上清，采用ELISA試劑盒檢測血清中的含量。具體操作按照試劑盒上的方法步驟進行。

29統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果以±s表示，采用SPSS 180軟件中的相應(yīng)程序分析處理數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）統(tǒng)計學(xué)分析后，2組間比較應(yīng)用t檢驗。P<005為統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性。

3結(jié)果

31LBP對腦缺血再灌注小鼠腦梗死范圍的影響缺血再灌 24 h后，假手術(shù)組小鼠腦組織沒有梗死灶，與假手術(shù)組比較MCAO組腦組織梗死百分比顯著升高；與MCAO組相比，給藥組LBP高、中劑量組及尼莫地平組腦梗死范圍明顯減小（P<001或P<005），提示LBP對小鼠缺血再灌注腦損傷有保護作用，見圖1。

32LBP對腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能缺損的影響缺血再灌24 h后，假手術(shù)組小鼠行為正常，無神經(jīng)功能缺損癥狀。MCAO組小鼠均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為缺陷癥狀，給藥組LBP高、中劑量組及尼莫地平組能明顯減輕小鼠神經(jīng)癥狀（P<005），提示LBP對缺血再灌注小鼠神經(jīng)損傷有明顯改善作用，見表1。

33LBP對腦缺血再灌注小鼠腦含水量的影響缺血再灌24 h后，與假手術(shù)組比較MCAO組小鼠腦含水量明顯升高（P<001），給藥組LBP高、中劑量組及尼莫地平組與MCAO組比較腦含水量明顯降低（P<005），提示LBP能夠抑制缺血再灌注損傷引起的腦水腫，見表1。

34LBP對腦缺血再灌注小鼠大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響光鏡下可見假手術(shù)組小鼠缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊、致密，細胞呈圓形或橢圓形，模型組小鼠缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)細胞大量變性壞死、萎縮，細胞分布不均勻，細胞核與細胞質(zhì)界限不清晰，胞核破碎或消失。與模型組相比，小鼠腦缺血再灌注后24 h，LBP干預(yù)組及尼莫地平組均可不同程度的改善缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)，壞死與凋亡的細胞數(shù)量減少。其中LBP高劑量組效果較顯著，而低劑量組的效果不明顯，見圖2。

35LBP對腦缺血再灌注小鼠大腦皮層NFκB p65蛋白表達的影響小鼠腦缺血再灌注后24 h，與假手術(shù)組相比，MCAO組小鼠大腦皮層缺血區(qū)p65蛋白表達明顯增高。LBP高、中劑量組p65蛋白水平較MCAO組顯著降低（P<001，P<005）。提示LBP能夠抑制缺血損傷小鼠大腦皮層NFκB表達的增高，見圖3。

36LBP對腦缺血再灌注小鼠血清TNFα，IL6和IL1β的影響與假手術(shù)組相比，小鼠腦缺血再灌注后24 h，模型組小鼠血清TNFα，IL6和IL1β水平均明顯升高，與模型組比較，LBP高、中、低劑量組均可明顯降低小鼠的血清TNFα和IL1β含量，LBP高、中劑量組可明顯降低小鼠血清IL6含量，見表2。

4討論

在缺血性腦血管病的治療中，恢復(fù)缺血區(qū)的血流或加強對缺血區(qū)的血流供應(yīng)是減輕缺血對中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷的必要條件。但是，大量研究表明，如果腦血流的疏通和恢復(fù)超過一定的時間點，不僅不能改善缺血引起的組織損傷和功能障礙，反而會造成神經(jīng)損傷進一步加重，這種現(xiàn)象即缺血再灌注損傷。抑制再灌注損傷是治療缺血性

腦血管病的重要環(huán)節(jié)[67]。本研究采用小鼠短暫性局灶性大腦中動脈阻塞模型觀察LBP對腦缺血再灌注損傷的作用，結(jié)果顯示LBP不但能夠改善缺血再灌注損傷小鼠的神經(jīng)功能障礙，而且能減小腦梗死體積，降低腦水腫的程度，病理切片也表明LBP可明顯改善腦缺血后神經(jīng)元的損傷，說明LBP干預(yù)對小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

腦缺血后，炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激、興奮性毒性等多種因素相互作用，相互影響，從而加劇神經(jīng)損傷的發(fā)生、發(fā)展[8]。近年來，核因子κB （nuclear factor kappa B，NFκB）信號通路激活在缺血性腦中風(fēng)引起的神經(jīng)細胞死亡中的作用倍受關(guān)注，成為治療缺血性腦血管病一個重要靶點[910]。NFκB是介導(dǎo)細胞增殖分化、細胞炎癥、凋亡和免疫應(yīng)答等作用的

關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，大腦中的NFκB主要由p65和p50亞單位組成，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)的細胞因子、炎癥分子、各種受體、蛋白等基因的表達和調(diào)控。腦缺血損傷時，NFκB在瀕臨死亡的神經(jīng)細胞中被激活，通過促進炎癥因子和促凋亡蛋白生成等許多潛在途徑誘導(dǎo)細胞死亡，從而在缺血性腦損傷病理過程中發(fā)揮重要作用[11]。本實驗中發(fā)現(xiàn)缺血再灌損傷后，小鼠大腦皮層缺血區(qū)NFκB p65蛋白表達明顯增高，NFκB被激活，LBP能顯著抑制缺血損傷引起的NFκB蛋白表達的增高，從而抑制NFκB的激活，可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制之一。

研究表明，腦缺血后NFκB等轉(zhuǎn)錄因子的激活使腦組織中的炎癥細胞如單核巨噬細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞等迅速活化，大量表達炎性細胞因子如TNFα，IL6，IL8，IL1β等，這些炎性細胞在發(fā)揮吞噬作用、免疫作用的同時，向細胞外釋放大量氧自由基、細胞因子、溶酶體酶等炎癥介質(zhì)，加重腦組織損傷，引起腦缺血再灌注損傷[12]。本實驗中發(fā)現(xiàn)缺血再灌損傷后，小鼠血清TNFα，IL6和IL1β水平均明顯升高，LBP能顯著抑制缺血損傷引起的血清TNFα，IL6和IL1β水平的增高，提示LBP具有調(diào)節(jié)缺血損傷后炎癥因子的生成，改善腦組織的微環(huán)境，從而減輕腦組織的病理損傷及缺血帶來的神經(jīng)功能障礙，從而起到對腦缺血損傷的保護作用。

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[責(zé)任編輯張寧寧]

[收稿日期]20160626

[基金項目]國家自然科學(xué)基金青年基金項目（31500822）；南通市社會事業(yè)科技創(chuàng)新與示范計劃項目（HS2013020）

[通信作者]*吳鋒，博士，副教授，Tel：（0513）85554335，Email：cuileish@163com