范 東，劉世操，祝愛俠,2*，陳 帆

(1.武漢輕工大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué) 畜禽飼料工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430023)

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香菇菌糠纖維素酶的提取工藝優(yōu)化

范 東1，劉世操1，祝愛俠1,2*，陳 帆1

(1.武漢輕工大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué) 畜禽飼料工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430023)

摘要：以香菇菌糠為原料，采用超聲浸提法制備纖維素粗酶液，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)，分析了超聲功率、超聲時(shí)間和液料比等因素對(duì)纖維素酶浸提的影響。結(jié)果表明，香菇菌糠纖維素酶最佳提取工藝為：超聲功率500 W，超聲時(shí)間15 min，液料比為20∶1，在此條件下的CMC酶活力為9.61 IU/g。

關(guān)鍵詞：香菇菌糠；纖維素酶；超聲波浸提法；響應(yīng)面分析

香菇菌糠是指香菇子實(shí)體采摘后剩余的廢棄培養(yǎng)基，其中含有大量的菌絲蛋白、多糖、纖維素酶等活性物質(zhì)[1]。我國(guó)作為香菇大國(guó)，每年產(chǎn)生大量的菌糠是顯而易見的，只有一部分會(huì)被運(yùn)用到飼料、燃料和餌料之上，絕大部分菌糠被丟棄而白白浪費(fèi)，這樣不僅造成資源的浪費(fèi)，而且還會(huì)嚴(yán)重污染環(huán)境[2-5]。為了促進(jìn)香菇行業(yè)的良性發(fā)展、為香菇行業(yè)創(chuàng)造收入，高效地開發(fā)提取香菇菌糠中的纖維素酶是有效利用的關(guān)鍵。

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱[6]。廢棄香菇菌糠中的菌絲體中含有豐富的纖維素酶。如果能夠把菌絲體中的纖維素酶提取出來，并制成酶制劑再添加到菌糠飼料生產(chǎn)中，有利于香菇菌糠的循環(huán)利用，更能降低纖維素酶的成本，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且生產(chǎn)出來的飼料可以替代部分糧食，從而緩解糧食短缺的問題。因此，本研究以香菇菌糠為原料，采用超聲浸提法，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化香菇菌糠中纖維素酶的提取工藝，以期為香菇菌糠中纖維素酶的回收利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗(yàn)材料香菇菌糠來源于武漢新洲徐古鎮(zhèn)天添食用菌生產(chǎn)基地。酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、重蒸酚、無水亞硫酸鈉、CH3COONa·3H2O、冰醋酸、羧甲基纖維素鈉、葡萄糖等均為市售。

1.1.2試驗(yàn)儀器微型粉碎機(jī)、數(shù)顯式恒溫水浴鍋、SHA-C恒溫水浴振蕩器、751分光光度計(jì)、TG16-W臺(tái)式高速離心機(jī)、分析天平。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1纖維素酶活的測(cè)定DNS氧化還原糖，能使溶液顯橙色。在一定還原糖的濃度范圍內(nèi)，還原糖的濃度越高橙色越深，可采用比色法求得還原糖的含量[7]。顯色原理見圖1。

不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的制備：按表1所示的吸取量，將500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液稀釋制備成6種濃度梯度的溶液，且試管依次標(biāo)號(hào)為0,1，…，5號(hào)。然后再依次編號(hào)為0′，1′，…，5′的試管中加入上述對(duì)應(yīng)管號(hào)中的溶液2.5 mL，再向1′，2′，…，5′號(hào)試管中都加入2.5 mL的DNS溶液，且0′號(hào)試管需加入2.5 mL的蒸餾水作為對(duì)照組。加完試劑后將各試管搖勻，最后將6支試管都放到煮開的熱水浴中煮5 min。5 min過后取出所有試管，把它們放到冰水浴中冷卻一段時(shí)間，冷卻后將各支試管中的溶液用蒸餾水稀釋3倍，稀釋完后在721型分光光度計(jì)上比色。選用厚度為0.5 cm的比色皿，分光光度計(jì)設(shè)置波長(zhǎng)為520 nm，按順序測(cè)得各個(gè)試管的光密度(OD)值。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后得出回歸方程。

采用羧甲基纖維素鈉(CMC)酶活力測(cè)定纖維素酶活力：在一支試管中，先量取經(jīng)過適當(dāng)稀釋過后的粗酶液0.5 mL，然后加入2.0 mL的CMC緩沖溶液，使勁振蕩試管使溶液得以充分混合，然后把它放到40 ℃的恒溫水浴鍋中0.5 h，用于酶液的糖化。糖化過后向試管中加入2.5 mL的DNS溶液。對(duì)照組的試驗(yàn)取一根空白試管，加入0.5 mL煮沸的酶液，然后依次加入2.0 mL的緩沖粗酶液、2.5 mL的DNS溶液。然后將加完試劑的2只試管同時(shí)放置于沸水浴中煮5 min，取出后用冷水加以冷卻，過后用蒸餾水稀釋3倍后用于分光光度計(jì)的測(cè)量。以第2支試管為對(duì)照，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)得OD值，查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線，將其代入回歸方程中，從而算出溶液中的葡萄糖含量。

CMC酶活的計(jì)算公式：

式中：G為樣品溶液中葡萄糖的含量(μg)；n為稀釋倍數(shù)；30為糖化半小時(shí)(min)；180為葡萄糖分子量(g/mol)。

1.2.2稀釋倍數(shù)對(duì)CMC酶活的影響稱取一定量自然干燥的香菇菌糠，然后向其中加入10倍蒸餾水，放在勻漿機(jī)中充分打碎，然后于40 ℃恒溫水浴振蕩器中放置45 min，濾液置于離心機(jī)中以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速離心一段時(shí)間，取上層清液即可。上清液用醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋不同的倍數(shù)，用于酶活力的測(cè)定。

1.2.3單因素試驗(yàn)酶是具有生物活性的物質(zhì)，提取結(jié)果受多種外界因子的影響。為了提取理想的酶活，故應(yīng)選擇最合適的條件，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

1.2.4響應(yīng)面設(shè)計(jì)在考察了上述3個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將這3個(gè)因素作為目標(biāo)變量，模型選用二次方程，試驗(yàn)因素及水平如表3所示。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，用分光光度計(jì)分別測(cè)得各管內(nèi)的光密度(OD)值。得到葡萄糖含量和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，并得出回歸方程：y=0.0017x+0.0069。結(jié)果表明，葡萄糖含量與吸光度具有良好的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9977，說明這種方法對(duì)微量葡萄糖的測(cè)定是可以接受的。

2.2稀釋倍數(shù)對(duì)CMC酶活力的影響

如圖3所示，當(dāng)稀釋倍數(shù)在2～3倍之間時(shí)，羧甲基酶的酶活性呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，說明此稀釋倍數(shù)是有利于纖維素酶的溶解釋放。當(dāng)稀釋的倍數(shù)超過3倍后，CMC酶活力逐步遞減，但最終不可能為0，說明酶的活性受到了抑制，因此選擇稀釋倍數(shù)為3倍。

2.3超聲功率對(duì)CMC酶活力的影響

如圖4所示，超聲波功率在300～600 W之間時(shí)，香菇菌糠菌絲細(xì)胞組織的破損力度隨著超聲波功率的增加而加強(qiáng)，那么流出來的纖維素酶量也會(huì)增多。當(dāng)功率在700～800 W之間時(shí)，羧甲基酶的活性降低，究其原因很可能是超聲波的強(qiáng)烈振動(dòng)使纖維素酶的結(jié)構(gòu)遭到破壞；另外，浸提液流動(dòng)得更快使物料在超聲場(chǎng)中更少的滯留也是超聲的作用，破壞細(xì)胞壁的程度也變得微弱了[8]。

2.4超聲時(shí)間對(duì)CMC酶活力的影響

如圖5所示，超聲時(shí)間在10～20 min時(shí)，菌絲細(xì)胞壁的破損細(xì)碎粒度和羧甲基纖維素酶溢出量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。當(dāng)時(shí)間超過20 min時(shí)，羧甲基纖維素酶的活性減弱，這可能是因?yàn)槊傅幕钚允艿饺艹鲭s質(zhì)抑制的緣故，0或者是超聲波機(jī)械剪切作用破壞了酶分子結(jié)構(gòu)的完整性。

2.5液料比對(duì)CMC酶活力的影響

如圖6所示，液料比小于30 mg/L時(shí)，隨著液料比的增加，羧甲基纖維素酶的活性也增大，因?yàn)殡S著浸提液體體積的增大，香菇菌糠和溶劑相互作用的時(shí)間就越長(zhǎng)，那么更多的酶會(huì)溶解出來。在液料比超過30時(shí)，羧甲基纖維素酶的活性會(huì)降低，這可能是在液料比失衡過大時(shí)，時(shí)間耽擱和能量耗費(fèi)的緣故，阻礙了超聲波順利破碎細(xì)胞的能力，使細(xì)胞破碎粒度下降[9]，從而使酶的得率減少；也有可能是因?yàn)橐毫媳忍?，浸提液中酶的濃度降低，?dǎo)致底物降解速度變慢，致使酶的活性喪失。

2.6響應(yīng)面分析法確定液制備最佳工藝條件

在考察了上述3個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果后，將這3個(gè)因素作為目標(biāo)變量，模型選用二次方程，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

2.6.1模型的建立與顯著性檢驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，建立數(shù)學(xué)模型，并根據(jù)模型方程得出最佳試驗(yàn)配方。得到的關(guān)于CMC酶活力(y1)的多元二次回歸模型方程為：

y1=55.183-0.047765x1-2.76545x2-0.31658x3+3.9×10-4x1x2+1.8×10-4x1x3+6.15×10-3x2x3+2.8075×10-5x12+0.05353x22+1.2325×10-3x32

式中：y1為CMC酶活力，x1為超聲功率，x2為超聲時(shí)間，x3為液料比。

對(duì)CMC酶活力為目標(biāo)函數(shù)建立的回歸模型進(jìn)行方程分析，回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，失擬項(xiàng)0.2840>0.05，不顯著，表明建立的回歸模型非常顯著，能夠較好地?cái)M合超聲功率、超聲時(shí)間和液料比對(duì)CMC酶活力的影響。該模型的回歸系數(shù)為0.9964，校正系數(shù)為0.9917，由此可見該方程的擬合程度較好，利用該模型對(duì)CMC酶活力優(yōu)化試驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析的準(zhǔn)確度較高。CMC酶活力受各種因素的影響不同，其中B、AB、AC、BC、A2、B2極為顯著，A、C和C2顯著。由方差分析結(jié)果可得，3個(gè)因素對(duì)CMC酶活力影響的大小為：B>C>A，即超聲時(shí)間>液料比>超聲功率。

2.6.2回歸模型的相應(yīng)曲面及等高線分析固定其中一個(gè)因素在零水平，可以通過模型方程作出三維曲面圖和二維等高線對(duì)其中2個(gè)試驗(yàn)因素進(jìn)行直觀分析，也可以分析各因素間的交互作用。

如圖7-a、圖7-b所示，當(dāng)液料比為30，超聲功率一定時(shí)，產(chǎn)品的CMC酶活力上升，香菇菌糠菌絲細(xì)胞壁破碎度和羧甲基纖維素酶溶出量都將隨之增加。如圖7-c、圖7-d所示，當(dāng)超聲功率為600 W，液料比一定時(shí)，隨著時(shí)間的推移，產(chǎn)品CMC酶活力先降后升；而超聲時(shí)間一定時(shí)，超聲功率越大，產(chǎn)品CMC酶活力降低，但變化并不顯著。如圖7-e、圖7-f所示，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min，比較超聲液料比與超聲功率對(duì)產(chǎn)品的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，液料比對(duì)產(chǎn)品的影響變化趨勢(shì)略顯著高于超聲功率。

注：*、**分別表示達(dá)顯著、極顯著水平。

2.6.3優(yōu)化工藝的驗(yàn)證通過響應(yīng)面軟件分析可以得知，香菇菌糠纖維素酶最佳提取工藝為：超聲功率500.08 W，超聲時(shí)間15.05 min，液料比為20，在此條件下CMC酶活力為9.6 IU/g。將試驗(yàn)條件做如下調(diào)整：超聲功率500 W，超聲時(shí)間15 min，液料比為20，在此條件下做3次重復(fù)試驗(yàn)，CMC酶活力為9.61 IU/g，與理論值較為接近，由此可知，依據(jù)此響應(yīng)面模型數(shù)據(jù)可有效指導(dǎo)試驗(yàn)操作。

3結(jié)論

本研究采用超聲波浸提法從香菇菌糠中提取具有商品價(jià)值的纖維素酶，為纖維素酶的進(jìn)一步分離純化提供了參考的依據(jù)。在本試驗(yàn)條件下對(duì)纖維素酶浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得了最佳的香菇菌糠纖維素酶的提取工藝：超聲功率500 W，超聲時(shí)間15 min，液料比為20，在此條件下CMC酶活力為9.61 IU/g。

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(責(zé)任編輯：曾小軍)

Optimization of Cellulase Extraction Process of Waste Material from Mushroom (Lentinusedodes)

FAN Dong1, LIU Shi-cao1, ZHU Ai-xia1,2*, CHEN Fan1

(1. Hubei Collaborative Innovation Center for Animal Nutrition and Feed Safety, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Wuhan Livestock Feed Engineering Technology Research Center, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：Cellulase of the waste material fromLentinusedodeswas prepared by ultrasonic extraction, the effects of ultrasonic power, ultrasonic time and liquid-solid ratio on the activity of cellulase were studied through single factor tests and response surface analysis. The results showed that the optimum process parameters were obtained as follows: ultrasonic power was 500 W, ultrasonic time was 15 min, liquid ratio was 20∶1, three validation tests under these conditions, the activity of the extracted cellulase was 9.61 IU/g.

Key words：Waste material fromLentinusedodes; Cellulase; Ultrasonic extraction; Response surface analysis

收稿日期：2015-03-29

基金項(xiàng)目：武漢輕工大學(xué)引進(jìn)(培養(yǎng))人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2013RZ04)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD36B05)。

作者簡(jiǎn)介：范東(1993—)，男，湖北宜昌人，主要從事飼料添加劑及資源開發(fā)與利用研究。*通訊作者：祝愛俠。

中圖分類號(hào)：S646.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-8581(2016)05-0083-05