李文利++傅以鋼++劉征宇++章忠輝++陸雅雅

摘要：藍(lán)藻“水華”的暴發(fā)對(duì)人體健康、水產(chǎn)養(yǎng)殖等造成了嚴(yán)重影響，微生物法是一種安全、有效的水華防治方法。通過(guò)碳源及氮源的單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面試驗(yàn)分析對(duì)A21菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。該培養(yǎng)基使A21菌株對(duì)銅綠微囊藻的葉綠素a（葉綠素a）清除效率提高了5.18%。

關(guān)鍵詞：藍(lán)藻；溶藻細(xì)菌；培養(yǎng)基；優(yōu)化；Plackett-Burman試驗(yàn)；響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0516-05

收稿日期：2015-04-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21277101）；上海海洋大學(xué)橫向課題（編號(hào)：D-8006-13-0117）。

作者簡(jiǎn)介：李文利（1988—），女，江蘇徐州人，碩士，主要從事食品微生物研究。E-mail：1067349333@qq.com。

通信作者：李曉暉，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：xhli@shou.edu.cn。

人為因素導(dǎo)致太湖水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程加速，于2007年暴發(fā)了大規(guī)?！八A”，給當(dāng)?shù)鼐用駧?lái)了恐慌[1]。近年來(lái)的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，60%太湖水域的營(yíng)養(yǎng)化水平處于中度污染以上，東萊水系等甚至達(dá)到重度污染，其余水域均為輕度污染[2-4]。微囊藻是太湖藍(lán)藻“水華”的優(yōu)勢(shì)藻類，銅綠微囊藻（Microcstis aeruginosa）是其代表藻株，其細(xì)胞內(nèi)含有多種色素蛋白，生長(zhǎng)速度極快，并產(chǎn)生對(duì)人體有害的微囊藻毒素[5-6]。水體富營(yíng)養(yǎng)化水平持續(xù)偏高帶來(lái)的“水華”現(xiàn)象令人堪憂，尋求一種高效、環(huán)保的抑藻物質(zhì)迫在眉睫。

從“水華”暴發(fā)水體中分離安全、有效的溶藻細(xì)菌是一種有效的防治手段和途徑，為水污染治理提供了新的研究思路[7-9]?，F(xiàn)已報(bào)道多株分離自太湖水域的溶藻細(xì)菌，為抑制藍(lán)藻“水華”現(xiàn)象提供了良好基礎(chǔ)，但大多處于分離鑒定階段，對(duì)于抑藻物質(zhì)制備成本高、生物活性低且不穩(wěn)定、二次污染等生物安全性問(wèn)題尚有待進(jìn)一步研究，以期實(shí)現(xiàn)溶藻微生物在治理“水華”中的應(yīng)用[10]。

本研究通過(guò)優(yōu)化溶藻菌株A21的培養(yǎng)基成分，提高對(duì)M. aeruginosa 905生物量的清除率。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)，選擇出溶藻菌株A21溶藻效果的主要影響成分；根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（response surface methodology，RSM），建立預(yù)估模型，得到估算的最佳培養(yǎng)基配方；根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，得到溶藻菌株A21的最佳培養(yǎng)基配方。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藻種和菌種

銅綠微囊藻905（M. aeruginosa 905）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物種質(zhì)庫(kù)淡水藻種庫(kù)，轉(zhuǎn)接至新鮮的BG11培養(yǎng)基中，于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h條件下培養(yǎng)[11]。溶藻菌株A21由筆者所在實(shí)驗(yàn)室利用原位取樣法[12]從太湖暴發(fā)藍(lán)藻“水華”的水域分離得到，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬。

1.1.2主要試劑

溶藻菌株A21的基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分為碳源5 g/L、氮源10 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L，采用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至70。營(yíng)養(yǎng)瓊脂和營(yíng)養(yǎng)肉湯用于A21菌株的活化和培養(yǎng)；魯格氏碘液用于藻細(xì)胞固定；丙酮用于銅綠微囊藻細(xì)胞葉綠素的提取。

1.1.3主要儀器

SPX-250PG型智能型光照培養(yǎng)箱（上海天恒醫(yī)療機(jī)械有限公司），SQ-UV2300型紫外可見分光光度計(jì)（北京宇艾奇電子科技有限公司），CX21型光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS 奧林巴斯），藻類計(jì)數(shù)框（新科儀器，計(jì)數(shù)區(qū) 20 mm×20 mm，100個(gè)小格），TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘潭湘儀儀器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1溶藻試驗(yàn)

A21菌株經(jīng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂活化后接種在新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。將菌液以4 000 r/min離心10 min，取0.5 mL上清液與4.5 mL生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的M. aeruginosa 905藻液進(jìn)行混合，同時(shí)取0.5 mL滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)液與4.5 mL生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的M. aeruginosa 905藻液混合作為對(duì)照組，置于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.2碳源和氮源的單因素選擇

根據(jù)微生物營(yíng)養(yǎng)代謝方式的不同，選擇可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、乙酸鈉等為碳源，選擇硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素為氮源。采用不同的碳源、氮源分別培養(yǎng)菌株A21后進(jìn)行溶藻試驗(yàn)。

1.2.3Plackett-Burman設(shè)計(jì)變量

采用Mintab 16軟件進(jìn)行Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)，對(duì)影響A21菌株生長(zhǎng)的9個(gè)培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，即碳源、氮源、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培養(yǎng)基初始pH值。每個(gè)因素取高水平和低水平2個(gè)水平，高水平為低水平的1.5倍。另設(shè)X4、X8、X12為虛擬列，在試驗(yàn)中為空，以考察試驗(yàn)誤差。以葉綠素a清除率（%）為響應(yīng)值，設(shè)定3個(gè)平行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定響應(yīng)面分析的因素與水平，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)。優(yōu)化A21菌株的培養(yǎng)基成分，并在最佳培養(yǎng)基成分配比下對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a清除率進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，證實(shí)響應(yīng)面分析法的可靠性。

1.2.5M. aeruginosa 905生物量指標(biāo)葉綠素a濃度的測(cè)定在超聲條件下使M. aeruginosa 905藻細(xì)胞破碎并釋放出葉綠素a，利用丙酮于低溫黑暗條件下萃取12 h后離心，分別于630、647、664、750 nm下測(cè)定上清液的吸光度[11-13]。根據(jù)公式（1）計(jì)算葉綠素a含量：

C（mg/L）=11.85（D664 nm- D750 nm）-1.54（D647 nm- D750 nm）-008（D630 nm- D750 nm）。[JY]（1）

式中，D664 nm、D647 nm、D630 nm、D750 nm分別表示波長(zhǎng)為664、647、630、750 nm 時(shí)提取液的吸光度。

根據(jù)公式（2）計(jì)算A21菌株的葉綠素a清除率（A）：

[JZ（]A=（1-Dt/Dc）×100%。[JZ）][JY]（2）

式中，Dt（mg/L）、Dc（mg/L）分別為試驗(yàn)組、對(duì)照組的葉綠素a濃度。

1.2.6數(shù)據(jù)處理利用Mintab 16、Design-expert 8.0、Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2結(jié)果與分析

2.1碳源及氮源的選擇結(jié)果

將A21菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于37 ℃下培養(yǎng)12 h，離心去除菌體后與銅綠微囊藻液混合，5 d后溶藻試驗(yàn)結(jié)果見圖1?？梢娖淙茉迥芰^好，經(jīng)計(jì)算得到葉綠素a清除率為80.34%。

[FK（W10][TPLWL1.tif]

以蛋白胨為氮源選擇不同碳源，其他成分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基一致，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。以蔗糖為碳源選擇不同氮源，其他成分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基一致，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。以蔗糖為碳源時(shí)，A21菌株對(duì)葉綠素a的清除率最高，為79.21%；以酵母膏為氮源時(shí)，A21菌株對(duì)葉綠素a的清除率最高，為81.27%。

2.2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

利用Mintab 16軟件進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，對(duì)影響

[TPLWL2.tif]

A21菌株生長(zhǎng)的9個(gè)培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，即蔗糖、酵母膏、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培養(yǎng)基初始pH值。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)創(chuàng)建試驗(yàn)次數(shù)n=20的試驗(yàn)，對(duì)12個(gè)因素（9個(gè)實(shí)際因素、3個(gè)虛擬因素）進(jìn)行考察。每個(gè)因素取高水平和低水平2個(gè)水平，以葉綠素a清除率（%）為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Mintab 16軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析（表3、圖4），可見培養(yǎng)基中蔗糖、酵母膏、磷酸鉀、初始pH

[TPLWL3.tif]

值對(duì)菌株A21的溶藻效果影響顯著（P<0.05）。R2為9433%，R2（預(yù)測(cè)）為95.34%，表明該結(jié)果的可信度較高。

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上確定4個(gè)主要影響因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，利用Design-Export 8.0軟件對(duì)蔗糖、酵母膏、磷酸鉀、初始pH值進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4、表5。

該響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)中心點(diǎn)，共有29個(gè)處理，重復(fù)3次以評(píng)估試驗(yàn)誤差。采用Design-Export 8.0數(shù)據(jù)處理軟件

對(duì)表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，以葉綠素a清除率（Y，%）為因變量，以蔗糖（X1，g）、酵母膏（X2，g）、磷酸鉀（X3，g）、[JP2]初始pH值（X4）為自變量建立回歸方程。根據(jù)表6中各因素的P值去除回歸方程中影響不顯著的因子，對(duì)二次回歸方程進(jìn)行優(yōu)化得到回歸方程：Y=80.485 2+0.572 5X1+2.096 7X2-2.245X3+0.412 5X4+1.22X1X2-1.302 5X1X3+2.47X2X3+1.315X2X4-1.667 5X3X4-5.839 75X12-2753 5X22。

由表6、表7可知，A21菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化回歸模型的P值<0.000 1，失擬的P值為0.508 1，表明回歸模型高度顯著（P<0.05），失擬檢驗(yàn)不顯著（P>0.05）。桑葉黃A21菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化回歸模型的校正確定系數(shù)R2為0.948 6，表明模型能解釋約94.86%響應(yīng)值的變化，僅有5.14%的總變異不能用該模型解釋。確定系數(shù)R2為0.974 3，表明模型擬合程度良好、試驗(yàn)誤差小，該回歸模型可用來(lái)分析和預(yù)測(cè)A21菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化的情況。

響應(yīng)面3D圖和等高線（圖5）可直觀反映各因素間的交互作用及其強(qiáng)弱[14-15]。

2.4最佳培養(yǎng)基配方與驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert V8.0.6軟件預(yù)測(cè)A21菌株的最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖6.475 g/L、酵母膏13.025 g/L、磷酸鉀 0.5 g/L、pH值8.2，此時(shí)A21菌株培養(yǎng)液的葉綠素a清除效率為85153 4%。根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，最佳試驗(yàn)配方為蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。進(jìn)行多次驗(yàn)證試驗(yàn)，菌株A21培養(yǎng)液的葉綠素a清除效率為84.5%，相對(duì)誤差為07%。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，菌株A21的葉綠素a清除效率提高了518%。

3結(jié)論

菌株A21是一株高效、安全的溶藻細(xì)菌，細(xì)菌中的某些代謝產(chǎn)物可促使藻細(xì)胞死亡。為進(jìn)一步提高菌株A21的溶藻能力，通過(guò)碳源和氮源的單因素選擇試驗(yàn)、PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌株A21的培養(yǎng)基成分和配比進(jìn)行研究，得到該菌株的最佳培養(yǎng)基配方，其葉綠素a清除效率由8034%提高至84.50%。[CM（21*2/3]本研究結(jié)果為菌株A21及其發(fā)酵產(chǎn)物在藍(lán)藻“水華”治理中的應(yīng)用提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ding L，Wu J Q，Pang Y，et al. Simulation study on algal dynamics based on ecological flume experiment in Taihu Lake，China[J]. Ecological Engineering，2007，31（3）：200-206.

[2]李娟英，曹宏宇，崔昱，等. 太湖流域主要水系水環(huán)境特征分析與富營(yíng)養(yǎng)化評(píng)價(jià)[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，2012，33（4）：7-13.

[3]錢益春，何平.1998—2006年太湖水質(zhì)變化分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（2）：370-374.

[4]Chen Y，Qin B，Teubner K，et al. Long-term dynamics of phytoplankton assemblages：Microcystis domination in Lake Taihu，a large shallow lake in China[J]. Journal of Plankton Research，2003，25（4）：445-453.

[5]陳水勇，吳振明，俞偉波，等. 水體富營(yíng)養(yǎng)化的形成、危害和防治[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，1999，2（2）：12-16.

[6]孔繁翔，高光. 大型淺水富營(yíng)養(yǎng)化湖泊中藍(lán)藻水華形成機(jī)理的思考[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25（3）：589-595.

[7]Imamura N，Motoike I，Shimada N，et al. An efficient screening approach for anti-Microcystis compounds based on knowledge of aquatic microbial ecosystem[J]. Journal of Antibiotics，2001，54（7）：582-587.

[8]van Hannen E J，Zwart G，van Agterveld M P，et al. Changes in bacterial and eukaryotic community structure after mass lysis of filamentous cyanobacteria associated with viruses[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（2）：795-801.

[9]趙傳鵬. 環(huán)境溶藻細(xì)菌的檢測(cè)與評(píng)價(jià)[D]. 南京：東南大學(xué)，2005.

[10]倪兆林，申元英. 溶藻類細(xì)菌的研究現(xiàn)狀[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（15）：2997-3000.

[11]Shao J H，Li R H，Joe E L，et al. Potential for control of harmful cyanobacterial blooms using biologically derived substances：problems and prospects[J]. Journal of Environmental Management，2013，125（1）：149-155.

[12]Hu X，Liu Y G，Zeng G M，et al. Effects of limonene stress on the growth of and microcystin release by the fr-eshwater cyanobacterium Microcystis aeruginosa FACHB-905[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2014，105（1）：121-127.

[13]安鑫龍，李豫紅，趙艷珍，等. 溶藻微生物的研究方法[J]. 水利漁業(yè)，2005，25（2）：17-18.

[14]周得慶，徐士菊. 微生物學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：134-142.

[15]Tahmouzi S. Optimization of polysaccharides from Zagros oak leaf using RSM：antioxidant and antimicrobial activities[J]. Carbohydrate polymers，2014，106：238-246.

[16]姜紹通，汪洪普，潘麗軍. 響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取芋頭多糖工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34（3）：215-219.