王雅雅　付瑞敏　于烽　陳五嶺

摘要：通過篩選出對植物土傳疾病具有良好拮抗效果的菌株BS-17，對其生防效果進行測定，旨在為開發(fā)植物土傳疾病廣譜抗菌生物制劑提供一定依據(jù)。采用平板對峙法，篩選出對9種常見植物土傳疾病具有拮抗效果的拮抗菌，抑菌率均在80%以上。利用形態(tài)學、生理生化及分子生物學的方法對其進行了鑒定，并對拮抗物質(zhì)產(chǎn)生的位置以及性質(zhì)進行初步研究；通過土壤定殖試驗對其生防潛力作出評價。通過形態(tài)學、生理生化及分子生物學的方法鑒定菌株BS-17為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。該菌產(chǎn)生的主要抗菌物質(zhì)分布于胞外，拮抗物質(zhì)對熱、pH值、紫外線以及蛋白酶均不敏感。此外，菌株BS-17具有較好的產(chǎn)纖維素酶及蛋白酶的能力。土壤定殖試驗證明，該菌表現(xiàn)出良好的定殖能力以及抑制病原菌生長的能力。菌株BS-17作為生防菌用于防治植物土傳疾病，具有較好的開發(fā)和利用價值。

關鍵詞：土傳疾病；拮抗菌；生防制劑；纖維素酶；蛋白酶；土壤定殖

中圖分類號：Q939.92 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-00102-05

土傳病害種類很多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的病害有100多種，其中危害比較嚴重的有50余種[1]。土傳病害發(fā)生嚴重時難以控制會導致作物減產(chǎn)甚至絕收[2-3]。目前，對于土傳病害主要采用輪作倒茬和化學農(nóng)藥的方法進行防治[4]。但由于土地資源有限以及化學農(nóng)藥防效差，因而尋求新的防治土傳病害的途徑已變得尤為重要。利用拮抗微生物防治作物土傳疾病病原菌生長繁殖，不僅能從源頭有效防治土傳病害，也是一種符合微生態(tài)原理的安全可靠的方法[5]。

生物防治由于其對人畜安全，環(huán)境友好，并且不易引起病菌抗藥性的產(chǎn)生，因而備受人們的關注[6]。目前，已報道的作為生防菌的主要微生物有芽孢桿菌、假單胞菌和鏈霉菌等[7-9]。生防細菌能夠通過自然競爭實現(xiàn)低毒、無污染、高效、穩(wěn)定的生物防控[10]。目前，用于抑制常見土傳疾病的廣譜抗菌效果的生防菌報道并不多見，通過篩選出具有廣譜高效抑制土傳疾病的生防菌并應用于實際防治中，具有十分重要的意義。從陜西閻良大棚甜瓜種植區(qū)以及陜西周至、眉縣獼猴桃田間所取的根際土壤樣品中分離出對常見的植物土傳疾病病原菌均具有良好拮抗效果的菌株，通過對其拮抗物質(zhì)產(chǎn)生部位以及性質(zhì)、土壤定殖情況研究來評價其生防潛力，旨在為開發(fā)各種生防制劑用于土傳疾病的實際防控奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

拮抗菌：從陜西閻良地區(qū)甜瓜種植大棚及陜西周至、眉縣獼猴桃田間所取的植物根際土壤樣品中分離篩選出。

病原菌：葡萄灰霉?。˙otrytis cinerea Pers）、甜瓜葉枯?。ˋlternariacucumerina （Ell. et Ev.） Elliott.）、辣椒疫病（Phytophthora capsici）、黃瓜枯萎?。–ucumber fusarium Wilt）、番茄青枯病（Ralstonia solanacearum）、桃根霉病菌（Rhizopus sp.）、小麥曲根霉（Rhizopustritici sp.）、甘藍黑腐?。╔anthomonas campestris pv. campestris）、獼猴桃白紋羽?。―ematophora nectatrix），西北大學農(nóng)業(yè)及環(huán)境微生物技術工程實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)以及LB培養(yǎng)基配方參照《微生物學實驗》[11]。纖維素培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.25 g、KH2PO4 0.5 g、瓊脂 20.0 g、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）2.0 g、剛果紅染料 0.2 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。酪素培養(yǎng)基：干酪素 4.0 g、ZnCl2 0.14 g、NaCl 0.16 g、CaCl2 0.002 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 0.002 g、Na2HPO4·7H2O 1.07 g、酪素水解液0.05 g、KH2PO4 0.36 g、瓊脂 20.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH值 6.5～7.0。

1.3 菌株分離與拮抗菌篩選

將取自各地的植物根際土壤樣本混合均勻，采用平板稀釋涂布法[12]進行分離，32 ℃倒置培養(yǎng)，將分離的菌株編號保存。采用平板對峙法，以甜瓜葉枯病為靶標篩選拮抗菌，相距2.5 cm處接種待篩菌株，28 ℃倒置培養(yǎng)3 d，重復3次試驗，以抑菌圈的大小作為篩選標準。待對照組未接拮抗菌的平板長滿病原菌，測量各試驗組的病原菌生長半徑r2，以對照組生長半徑為r1，則抑菌率=（r1-r2）/r1×100%。以抑菌率大小作為平板拮抗菌拮抗能力強弱的標準，保存所得復篩菌株。

1.4 拮抗菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定及生理生化鑒定 通過對拮抗菌進行顯微鏡下形態(tài)、菌落形態(tài)的觀察，以及生理生化指標測定，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]對拮抗菌進行鑒定。

1.4.2 分子生物學鑒定 細菌基因組總DNA的提取參照《微生物學實驗》，PCR擴增引物序列正向引物為：5′-AGAGTTGATCCTG-GCT-CAGAACGAACGCT-3′，反向引物為：5′-TACGGCTACCTTGTTAC-GACTTCACCCC-3′。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，然后送生物公司進行測序。將所得序列在NCBI利用Blast進行序列相似性比對分析，然后利用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 抑菌譜的測定

以9種土傳疾病的病原為靶標，采用平板對峙法，測定拮抗菌的抑菌譜。每組試驗重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照組病原菌鋪滿平板，計算各組抑菌率大小。

1.6 拮抗物質(zhì)存在位置的確定

1.6.1 無菌發(fā)酵液的檢測 將分離篩選得到的拮抗菌 BS-17 接種到NA液體培養(yǎng)基中，32 ℃ 170 r/min培養(yǎng)72 h，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。以0.22 μm過濾器過濾即為無菌發(fā)酵液，以杯碟法對無菌發(fā)酵液的拮抗活性進行檢測。

1.6.2 細胞提取物的檢測 將拮抗菌BS-17接種到NA液體培養(yǎng)基中，32 ℃ 170 r/min培養(yǎng)48 h，備用。采用康為世紀生物科技公司革蘭氏陽性菌蛋白抽提試劑盒（目錄號：CW0890）對拮抗菌BS-17進行胞內(nèi)物質(zhì)提取。提取過程：拮抗菌發(fā)酵液3 000 g、4 ℃下離心5 min，以500 mg菌體加入500 μL抽提試劑使菌體重懸，冰上孵育20 min，12 000 r/min離心10 min，取上清。0.22 μm過濾器過濾，以杯碟法對細胞提取物的拮抗活性進行檢測。

1.7 抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究

1.7.1 拮抗物質(zhì)對熱穩(wěn)定性 按照“1.6.1”節(jié)的方法制備無菌發(fā)酵液，取10 mL于7支試管中，分別在溫度為0、20、40、60、80、100、121 ℃下處理30 min，然后以0.22 μm過濾器過濾。以杯碟法檢測其拮抗活性，以抑菌率作為指標。

1.7.2 拮抗物質(zhì)對酸堿穩(wěn)定性 按“1.6.1”節(jié)方法制備無菌發(fā)酵液，取10 mL于7支試管中，分別在pH值3、4、5、6、7、8、9下處理2 h，再調(diào)節(jié)發(fā)酵液為初始pH值，以 0.22 μm 過濾器過濾。以杯碟法檢測其拮抗活性，以抑菌率作為指標。

1.7.3 拮抗物質(zhì)對紫外線敏感性 按照“1.6.1”節(jié)的方法制備無菌發(fā)酵液，取10 mL于7支試管中，分別在40 W紫外燈下照射0、2、4、6、8、10、12 h，然后以0.22 μm過濾器過濾。以杯碟法檢測其拮抗活性，以抑菌率作為指標。

1.7.4 拮抗物質(zhì)對蛋白酶的穩(wěn)定性 按照“1.6.1”節(jié)的方法制備無菌發(fā)酵液，取10 mL于4支試管中，分別加入蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶在恒溫37 ℃下處理1 h，然后以0.22 μm過濾器過濾。以杯碟法檢測其拮抗活性，以抑菌率作為指標。

1.8 BS-17產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶活性研究

1.8.1 BS-17產(chǎn)纖維素酶及蛋白酶平板檢測 纖維素酶平板檢測：將拮抗菌BS-17接種于纖維素平板上，32 ℃培養(yǎng) 72 h，觀察有無透明圈，若出現(xiàn)透明圈，則說明有纖維素酶的存在，反之，則說明無纖維素酶。

蛋白酶平板檢測：將拮抗菌BS-17接種于酪素培養(yǎng)基平板上，32 ℃培養(yǎng)72 h，觀察有無透明圈，若出現(xiàn)透明圈，則說明有蛋白酶的存在，反之，則說明無蛋白酶。

1.8.2 BS-17產(chǎn)纖維素酶及蛋白酶活力檢測 粗酶液的制備：將拮抗菌BS-17接種于NA液體培養(yǎng)基，放置于37 ℃、170 r/min搖床中培養(yǎng)，發(fā)酵液4 000 r/min離心取上清，為粗酶液。分別從2 d開始，每隔1 d測定一次直至7 d。

纖維素酶活力測定采用3，5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測定酶解液中還原糖含量。具體如下：加入含1%CMC-Na檸檬酸緩沖液稀釋酶液，每0.5 mL粗酶夜加入 1.5 mL 緩沖液，50 ℃水浴30 min，加入3 ml DNS試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻并于540 nm處測定其吸光度。在上述條件下，每分鐘酶液催化纖維素水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量為1個酶活性單位（U）。葡萄糖標準曲線見圖1。

蛋白酶活性測定：采用福林法測定蛋白酶的活性，參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》，酶活定義為：1 mL 發(fā)酵液在40 ℃ 和 pH 值7.2條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生 1 μg 酪氨酸為1個酶活單位。酪氨酸標準曲線見圖2。

1.9 土壤定殖能力測定

1.9.1 雙抗法標記菌株 采用抗利福平和抗病原菌雙抗法標記拮抗菌BS-17，將菌株BS-17接種到含5 μg/mL利福平的NA培養(yǎng)基上，逐步篩選出能夠在300 μg/mL利福平的NA培養(yǎng)基穩(wěn)定生長且對病原菌拮抗效果較之前相同的BS-17突變菌株。

1.9.2 定殖試驗 孢子懸液制備：以甜瓜葉枯病病原菌為靶標，接種于PDA培養(yǎng)基上，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 d，以無菌水沖洗菌落表面，經(jīng)雙層滅菌紗布過濾，利用血球計數(shù)板計數(shù)，以無菌水配置成8.0×104 CFU/mL的病原菌孢子懸液，備用[14]。

菌懸液制備：將BS-17突變株接種于裝有5 mL生理鹽水的比濁管中，振蕩均勻，采用麥氏比濁儀測定其菌體濃度，取0.5麥氏的菌懸液備用，即濃度為1×108 CFU/mL。

將取自甜瓜大棚種植區(qū)內(nèi)同一地點的健康土分成3組，分別做如下處理：接種甜瓜葉枯病病原菌，病原菌孢子懸液接種量為 1×108 CFU/g；接種拮抗菌BS-17突變株，接種量為 1×108 CFU/g；未接種病原菌以及拮抗菌BS-17的健康土。

試驗組設置如下：將200 g接種病原菌的病土與BS-17突變菌菌懸液進行混合，使BS-17菌體接種量為1×108 CFU/g；以加入相同體積的生理鹽水的病土為對照組；拮抗菌BS-17濃度為1×108 CFU/g健康土。放置于溫度為 30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱，每試驗組平行3次，測定初始各實驗組中病原菌以及拮抗菌BS-17的菌體濃度，然后每3.5 d測定1次菌體數(shù)目的變化情況。

1.9.3 定殖情況檢測 每隔3.5 d取各試驗組10 g土于 90 mL 裝有滅菌玻璃珠的無菌水中，震蕩均勻，采用梯度稀釋法，配制不同濃度菌懸液，分別取1 000 μL涂布于含 300 μg/mL 利福平的NA培養(yǎng)基，對菌株BS-17數(shù)量進行統(tǒng)計，以血球計數(shù)法對病原菌進行統(tǒng)計，觀察BS-17菌的定殖情況。

2 結果與分析

2.1 菌株分離與拮抗菌篩選

從采集的土樣中分離出了289株菌，其中43株菌具有拮抗效果，抑菌圈直徑較明顯的有18株菌，分別命名為BS-1至BS-18。抑菌率在50%以上的拮抗菌有9株，其中BS-17抑菌效果最佳，并且性質(zhì)穩(wěn)定（表1）。經(jīng)過10次傳代培養(yǎng)后，抑菌效果無明顯變化；因此，將BS-17用作后續(xù)研究。

2.2 拮抗菌BS-17的鑒定

2.2.1 形態(tài)學及生理生化鑒定 利用梯度稀釋法獲取菌株單菌落，BS-17單菌落形態(tài)表現(xiàn)為菌落呈白色不透明、邊緣不整齊、表面褶皺，中間可形成近圓形褶皺。革蘭氏染色呈陽性，桿狀，產(chǎn)芽孢，菌株的淀粉反應呈陽性。

2.2.2 BS-17菌株16S rDNA序列分析 將BS-17菌株16S rDNA測序序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進行比對，利用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結果表明，菌株BS-17與已知解淀粉芽孢桿菌的同源性為99%，結合形態(tài)學及生理生化鑒定，將菌株BS-17鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.3 抑菌譜的測定

采用平板對峙法，以常見的9種植物土傳疾病的病原菌為靶標，以菌株BS-17為拮抗菌的抑菌譜的測定，結果表明，BS-17 對9種土傳疾病的病原菌均具有良好的抑制效果（表2）。

2.4 拮抗物質(zhì)存在位置

由圖4可以看出，BS-17無菌發(fā)酵液對病原菌抑菌作用遠遠大于細胞提取物，細胞提取物對病原菌抑制作用不明顯，說明抑菌物質(zhì)主要存在于菌株BS-17胞外分泌物中。

2.5 抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究

2.5.1 拮抗物質(zhì)對熱穩(wěn)定性 以杯碟法分別對溫度為0、20、40、60、80、100、121 ℃處理的無菌發(fā)酵液抑菌活性進行檢測。由圖5可知，抑菌物質(zhì)對熱穩(wěn)定性好，經(jīng)過高溫100 ℃處理，抑菌活性降低，而在121 ℃時仍有一定活性。

2.5.2 拮抗物質(zhì)對酸堿穩(wěn)定性 以杯碟法分別對pH值為3、4、5、6、7、8、9處理的無菌發(fā)酵液拮抗活性進行檢測。由圖6可知，拮抗物質(zhì)對酸堿穩(wěn)定性好， 在較廣pH范圍內(nèi)均具有拮抗活性。

2.5.3 拮抗物質(zhì)對紫外線敏感性 以杯碟法分別對紫外燈照射0、2、4、6、8、10、12 h處理的無菌發(fā)酵液進行拮抗活性檢測。由圖7可知，拮抗物質(zhì)對紫外線不敏感。

2.5.4 拮抗物質(zhì)對蛋白酶穩(wěn)定性 以杯碟法分別檢測拮抗物質(zhì)對蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性。由圖8可知，拮抗物質(zhì)對蛋白酶不敏感。

2.6 BS-17產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶活性研究

2.6.1 BS-17產(chǎn)纖維素酶及蛋白酶平板檢測 將所篩選的拮抗菌BS-17分別接種到纖維素培養(yǎng)基以及酪素培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，72 h后觀察透明圈。由圖9可知，BS-17均能夠產(chǎn)生纖維素酶以及蛋白酶。左圖為纖維素酶檢測結果，右圖為蛋白酶檢測結果。

2.6.2 BS-17產(chǎn)纖維素酶及蛋白酶酶活力檢測 由表3可以看出，纖維素酶的活力隨著發(fā)酵時間的延長而增加，酶活力4 d后增加緩慢。從酶活力可以看出，BS-17具有較高的纖維素酶產(chǎn)生能力。

2.7 菌株BS-17土壤定殖能力測定

2.7.1 BS-17突變菌株的獲得 通過抗藥性篩選，最終獲得能夠在300 μg/mL利福平抗性平板上穩(wěn)定生長的突變菌株。突變菌株較原菌株菌落小，菌落形態(tài)無太大差異（表5）。以甜瓜葉枯病病原菌為靶標，經(jīng)過對峙法及杯碟法等抑菌活性檢測，發(fā)現(xiàn)其跟原菌株無差異。

表5 原BS-17菌株與BS-17突變菌株比較

菌株菌落直徑（mm）抑菌圈（cm）抑菌率（%）

BS-17菌株13.64.088.9

BS-17突變菌株12.54.088.2

2.7.2 土壤定殖檢測 菌株BS-17在土壤中數(shù)量的動態(tài)變化如圖10。BS-17菌株在健康土與病土中定殖情況大致為：先降低，再上升，再降低，最后趨于平穩(wěn)。在14.5 d之后，病土中BS-17菌株的數(shù)目高于健康土，這可能是因為病原菌生長代謝產(chǎn)物刺激了拮抗菌的快速繁殖。

由圖11可知，未接拮抗菌的對照組病原菌在土壤中呈波浪線趨勢變化，菌懸液處理的病土中病原菌數(shù)量大幅度下降，說明拮抗菌對病原菌具有抑制效果。在21 d以后，對照組病原菌的數(shù)目逐漸趨于穩(wěn)定，菌懸液處理的病土中病原菌數(shù)量逐漸增加，說明在35 d時拮抗菌的數(shù)目不足以抑制病原菌的生長。

3 討論與結論

本研究分離篩選出對常見植物土傳疾病具有較好拮抗效果的菌株BS-17，通過鑒定該拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌。菌株BS-17的主要拮抗活性物質(zhì)存在于胞外物質(zhì)中，經(jīng)過試驗研究發(fā)現(xiàn)拮抗物質(zhì)對熱、pH值、紫外線以及蛋白酶的穩(wěn)定性好，說明該菌具有開發(fā)研制成生防菌劑的潛力。

另外，該拮抗菌有較高的產(chǎn)纖維素酶及蛋白酶的能力，夠抑制多種病原菌以及土壤中的病蟲害。例如纖維素酶對卵菌綱真菌具有重要的抑制作用[15]，蛋白酶對土壤中多種病害以及線蟲都具有顯著抑制和殺滅的作用[16-18]等。經(jīng)過利福平及抗病原菌雙抗標記法，篩選出的突變株用于土壤定殖試驗，結果表明，菌株BS-17的定殖能力強，在土壤中表現(xiàn)出較高的抑菌活性。由于在實際大田應用中，自然田間差別很大，生防菌在施用過程中受多種條件的影響，因此，在生防菌應用于實際田間抗病試驗時，需進一步確定生防菌在土壤中的定殖情況以確定最佳的施用量。

本研究篩選出的拮抗菌不僅具有廣泛的抑制植物土傳疾病病原菌的效果，并且其拮抗物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，對熱、酸堿、紫外線以及蛋白酶均有良好的耐性。該拮抗菌具有較好的產(chǎn)纖維素酶及蛋白酶的能力，因此，具有廣泛抑制土壤中多種病菌的潛力。

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