蔣向輝　劉良科　佘朝文

摘要：在對(duì)葛屬11份種質(zhì)核rDNA ITS序列克隆測(cè)序的基礎(chǔ)上，用MEGA 6.0軟件對(duì)11份種質(zhì)及其近緣種進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，葛屬11份種質(zhì)的ITS序列在長(zhǎng)度和G+C含量上相差較大，長(zhǎng)度變化在669～765 bp之間，最大相差96 bp，G+C含量在52.98%～59.89%，最大相差6.91%；藤縣粉葛（Tengxian Pueraria thomsonii）、常德粉葛（Changde Pueraria thomsonii）、武隆苦葛（Wulong Pueraria peduncularis）這3個(gè)種的ITS序列特點(diǎn)相近，G+C含量都在53.74%左右，長(zhǎng)度小于700 bp，在發(fā)育樹(shù)上聚為1類，種質(zhì)親緣關(guān)系很近；合川粉葛（Hechuan Pueraria thomsonii）和蒙自粉葛（Mengzi Pueraria thomsonii） ITS序列相似性較高，G+C含量與序列長(zhǎng)度都相差不大，在發(fā)育樹(shù)上聚為1類；通道山葛（Tongdao Pueraria montana）聚為1類，與其他物種存在較遠(yuǎn)的距離；德興宋氏超級(jí)粉葛（Dexing Soong Super Pueraria thomsonii）與常寧野葛（Changning Pueraria lobata）ITS序列和G+C含量一樣，在發(fā)育樹(shù)上聚為1類，但與會(huì)同山葛（Huitong Shange）、大衛(wèi)粉葛（Dawei Pueraria thomsonii）處于不同的分支上，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：葛屬；ITS序列；親緣關(guān)系；聚類分析

中圖分類號(hào)： S567.902.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0046-04

葛（Pueraria lobata）別稱葛藤、葛麻葉，系豆科碟形花亞科（Phaseolease）葛屬植物，最先產(chǎn)于中國(guó)和日本的琉球地區(qū)[1]，中國(guó)最早關(guān)于葛的記載是在《詩(shī)經(jīng)》和《神農(nóng)本草經(jīng)》上。世界上葛有20個(gè)種，我國(guó)有12個(gè)種，其中常被作為藥用的有8個(gè)種，我國(guó)除新疆維吾爾自治區(qū)、西藏壯族自治區(qū)和青?；刈遄灾螀^(qū)3個(gè)省份外，其他省份都有葛分布的相關(guān)報(bào)道，產(chǎn)量高和資源比較豐富的種類有野葛與粉葛[2]。葛莖是我國(guó)南方一些?。▍^(qū)）的一種常食蔬菜，葛根含異黃酮成分葛根素、葛根素木糖苷、大豆黃酮、大豆黃酮苷及β-谷甾醇、花生酸，又含多量淀粉，有解表退熱、生津止渴、止瀉的功能，能改善高血壓、糖尿病病人的項(xiàng)強(qiáng)、頭暈、頭痛等癥狀[3]。葛根毒性低、藥源廣、價(jià)格低，因此，加強(qiáng)對(duì)葛根的新藥和保健品開(kāi)發(fā)具有良好的前景。

根據(jù)2010版《藥典》規(guī)定，野葛和粉葛都可以作為葛的正品使用，但它們是同科不同屬的2種植物，有效成分含量差異較大，在開(kāi)發(fā)利用中對(duì)其來(lái)源的均一性難以保證，因此，采用合適的標(biāo)記對(duì)葛種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析具有重要的意義。葛屬不同種之間形態(tài)差異較小，根據(jù)形態(tài)學(xué)來(lái)判定葛屬種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系存在較多的爭(zhēng)議，目前，國(guó)內(nèi)在分子水平上鑒定葛屬種質(zhì)之間親緣關(guān)系的研究報(bào)道尚少。本研究基于ITS序列對(duì)葛屬11份種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，在分子水平上進(jìn)一步鑒定葛屬11份種質(zhì)的親緣關(guān)系，為葛屬不同來(lái)源的種質(zhì)區(qū)分與鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為葛屬不同來(lái)源的11種種質(zhì)（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

采用改良的CTAB法提取葛屬11份種質(zhì)基因組DNA。用于擴(kuò)增的ITS序列引物參照White等設(shè)計(jì)的ITS通用引物[4]，上游引物為ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物回收采用長(zhǎng)沙安比奧生物試劑有限公司生產(chǎn)的DNA回收試劑盒，將回收產(chǎn)物與pMD 18-T質(zhì)粒相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌（E. coil）DH5α（菌株來(lái)自湖南大學(xué)生物學(xué)院）；獲得重組菌斑，采用長(zhǎng)沙安比奧生物試劑有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，在雙酶切鑒定后送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列經(jīng)比對(duì)確認(rèn)，將序列在GENEBANK上登錄，獲得登錄號(hào)。根據(jù)獲得的序列，以NCB網(wǎng)站已有的甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]ITS序列為外類群，利用MEGA 6.0軟件，分別采用MP法、NJ法和UPGMA法3種方法對(duì)11份種質(zhì)及其近緣種進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列分析

一般情況下，每個(gè)物種DNA中G+C的含量是特定的，能夠反映屬種之間的親緣關(guān)系，DNA中G+C含量越高，其變異也越?。挥H緣關(guān)系越近，不同物種之間DNA中G+C含量的差別越小[5]。由表2可見(jiàn)，11份種質(zhì)ITS序列G+C含量有很大的差異，G+C含量在52.98%～59.89%之間，最大相差6.91百分點(diǎn)，其中大衛(wèi)粉葛G+C含量相對(duì)最高，ITS1序列中G+C含量為54.08%～64.05%，ITS2序列中G+C含量為5169%～64.19%，ITS1序列G+C含量比ITS2序列變化稍大；序列長(zhǎng)度波動(dòng)范圍也較大，大小在669～765 bp，相差 96 bp，其中，通道山葛的ITS序列相對(duì)最長(zhǎng)；德興宋氏超級(jí)粉葛和常寧野葛G+C含量和序列長(zhǎng)度相同，G+C含量為5458%，序列長(zhǎng)度為731 bp；常德粉葛和蒙自粉葛G+C含量和序列長(zhǎng)度相似。從序列長(zhǎng)度來(lái)看，ITS1序列的變異范圍在242～331 bp之間，ITS2序列的變異范圍在178～279 bp，5.8S序列相對(duì)保守，序列長(zhǎng)度在169 bp左右。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

由表3可見(jiàn)，葛屬11份種質(zhì)和外類群植物甘薯的遺傳距離為0.002～0.792，藤縣粉葛與武隆苦葛、德興宋氏超級(jí)粉葛與常寧野葛、藤縣山葛與會(huì)同山葛的遺傳距離均最小，為0.002，相互間的親緣關(guān)系最為接近；其次是常德粉葛與武隆苦葛，遺傳距離為0.004；遺傳距離最大的是蒙自粉葛與番薯，達(dá)到0.792，這兩者的親緣關(guān)系相對(duì)最遠(yuǎn)。