謝海強(qiáng) 孫巖巖 盤道興 錢成 康建兵 胡玲玲 龔俞 焦仁剛 劉若余

摘要：利用黔北麻羊、貴州黑山羊和貴州白山羊構(gòu)建DNA池，設(shè)計(jì)1對引物擴(kuò)增其STAT5A基因第10外顯子及部分內(nèi)含子序列。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行雙向測序。DNAStar和BLAST分析確定多態(tài)性位點(diǎn)。利用生物信息學(xué)軟件分析SNPs位點(diǎn)對STAT5A基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、STAT5A蛋白二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：在擴(kuò)增的STAT5A基因中篩選到3個(gè)SNPs：C-32A、G+71A和G+158A，其中G+71A為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的丙氨酸（Ala）變?yōu)樘K氨酸（Thr）；C-32A和G+158A均在內(nèi)含子區(qū)，不參與氨基酸編碼。SNPs位點(diǎn)對STAT5A基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和STAT5A蛋白結(jié)構(gòu)均有一定影響。

關(guān)鍵詞：STAT5A基因；SNPs；外顯子；貴州本地山羊

中圖分類號(hào)： S827.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0030-03

收稿日期：2014-07-24

基金項(xiàng)目：貴州省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃（編號(hào)：黔科合重大專項(xiàng)字[2011]6009號(hào)）；黔西南州種草養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展省州科技合作專項(xiàng)（編號(hào)：黔西南科合字[2011]5-3號(hào)）；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（編號(hào)：研農(nóng)2014012）。

作者簡介：謝海強(qiáng)（1989— ），男，江蘇常州人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿舆z傳與動(dòng)物育種。E-mail：xiehaiqiang1115@163.com。

通信作者：劉若余，博士，教授，主要從事分子遺傳與動(dòng)物育種研究。E-mail：liury04@163.com。

STAT5是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子蛋白（signal transduction and activator of transcription，STAT）家族中的重要成員之一，它包括STAT5A和STAT5B這2個(gè)亞型，其STAT同源性家族成員共有7個(gè)，分別為STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B及STAT6[1]。 在眾多家族成員中，STAT5肩負(fù)著眾多功能，它不僅參與細(xì)胞增殖、分化與凋亡的過程，調(diào)控細(xì)胞周期，還對生物體生長和免疫應(yīng)答起重要調(diào)控作用。STAT5能夠?qū)崿F(xiàn)如此多功能，主要是通過其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制來完成，主要有JAK2-STAT5[2]、JAK3-STAT5[3]、STAT5-Foxp3[4]等信號(hào)通路 。

STAT5A和STAT5B在結(jié)構(gòu)與功能相近，序列具有很高的同源性，它們都擁有高度保守的N端結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)蛋白間相互作用的蜷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，能與DNA直接結(jié)合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，還都具有最具保守性的SH2結(jié)構(gòu)域[5]。但2者在C端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域略有不同，具體表現(xiàn)為STAT5A和STAT5B在C端分別擁有20個(gè)和8個(gè)獨(dú)特氨基酸序列[6]。STAT5的2個(gè)亞型蛋白不僅在結(jié)構(gòu)上同源性極高，而且在功能上有許多相同點(diǎn)。STAT5A和STAT5B同時(shí)扮演著信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子的角色，它們能被生長激素（growth hormone，GH）、干擾素（interferon，IFN）、催乳素（prolactin）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）及白細(xì)胞介素（interleukin，IL）等多種因子激活，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)。

STAT5A最早作為調(diào)控乳蛋白的一個(gè)乳腺因子（mammary gland factor，MGF）而被發(fā)現(xiàn)，在隨后的研究中，發(fā)現(xiàn)STAT5A不僅對調(diào)控乳腺正常發(fā)育具有重要作用，還在肝細(xì)胞活性水平、免疫系統(tǒng)以及腫瘤調(diào)控機(jī)制[7-9]等方面都有十分重要作用。近年來，還發(fā)現(xiàn)STAT5A與生物生長性能有著密切聯(lián)系。如Yu等在小鼠上證明了STAT5A和STAT5B通過激活 Cdkn2b 和Cdkn1a表達(dá)來負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖[10]；方瓊等在研究家豬STAT5時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)生長激素進(jìn)而影響生長性狀[11]；此外，在研究嶗山奶羊時(shí)，劉園峰等發(fā)現(xiàn)STAT5A第9內(nèi)含子上存在2個(gè)連鎖突變位點(diǎn)，這2個(gè)突變位點(diǎn)顯著影響著嶗山奶羊的體質(zhì)量、體長和胸圍等生長性狀[12]。

貴州本地山羊具有繁殖力強(qiáng)、屠宰率高、耐粗飼、易管理等特點(diǎn)，且其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛[13]。但貴州本地山羊存在生長速度慢、個(gè)體生產(chǎn)性能參差不齊等問題，導(dǎo)致養(yǎng)羊效益不佳，因此提高其生長性能是解決上述問題的關(guān)鍵。與傳統(tǒng)繁殖飼養(yǎng)方面提高山羊生長性能相比，從分子水平研究效果更明顯、周期更短、回報(bào)率更高。但能用于育種的有用基因或標(biāo)記仍然十分緊缺，而STAT5A則是十分理想的提高家畜生長性能的候選基因。

本試驗(yàn)利用黔北麻羊、貴州黑山羊和貴州白山羊進(jìn)行DNA池構(gòu)建[14]，進(jìn)行STAT5A基因多態(tài)性位點(diǎn)（single nucleotide polymorphism，SNP）篩選。測序結(jié)果由DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接、校正，BLAST分析其SNP，并估算等位基因頻率，生物信息學(xué)軟件研究多態(tài)性位點(diǎn)對STAT5A基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)材料為貴州本地的黔北麻羊、貴州白山羊和貴州黑山羊。其中貴州省遵義市習(xí)水縣富興牧業(yè)種羊場黔北麻羊103只，貴州省畢節(jié)市納雍縣鵬騰生態(tài)農(nóng)牧綜合開發(fā)有限公司貴州黑山羊103只，貴州省銅仁市沿河縣貴州白山羊種羊場貴州白山羊146只。

1.2 試驗(yàn)試劑

生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（血液），瓊脂糖凝膠，1×TBE緩沖液。

1.3 DNA提取與DNA池構(gòu)建

抽取黔北麻羊血樣103個(gè)，貴州黑山羊血樣103個(gè)，貴州白山羊血樣146個(gè)。用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（血液）提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，紫外分光光度計(jì)測定DNA樣品濃度。貴州黑山羊及貴州白山羊DNA樣品分別調(diào)整相同濃度至100 ng/μL，各取3 μL混合構(gòu)建DNA池。

1.4 引物設(shè)計(jì)和DNA擴(kuò)增

從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到綿羊STAT5A基因DNA序列（GenBank登錄號(hào)：NC_019468.1），利用NCBI在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)1對特異性引物。其上游引物序列（5′→3′）為TTTGCTCGGATGCTCTCAGG，下游引物序列（5′→3′）為AGCAAATAAGCACCAGCAGA，目標(biāo)基因片段（包含STAT5A基因第10外顯子編碼區(qū)序列及部分3′UTR序列）長度 630 bp，最適退火溫度58.3 ℃。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq PCR Master Mix試劑10 μL，基因組DNA 2 μL，上、下游引物（濃度為10 pmol/μL）各1.5 μL，ddH2O 5 μL。采用 TC-512 PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s；58.3 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后 72 ℃ 延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

1.5 序列分析

PCR產(chǎn)物委托北京諾薩基因組研究中心有限公司純化后進(jìn)行雙向測序，3次獨(dú)立測序。采用DNAstar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行校正，BLAST分析確定SNPs。

1.6 測序圖峰高測量及等位基因頻率估算

利用軟件Chromas.exe查看測序結(jié)果，并利用MWSnap測量各SNP位點(diǎn)等位基因的相應(yīng)峰高。SNP常表示二等位多態(tài)性，可通過以下公式估算等位基因頻率[15]。

fi=hi/（hⅠ+hⅡ），i=Ⅰ，Ⅱ。

式中：fi表示SNP位點(diǎn)某等位基因頻率，hⅠ和hⅡ分別表示測序圖上該SNP等位基因Ⅰ、Ⅱ峰高度。

1.7 STAT5A的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及蛋白結(jié)構(gòu)分析

將STAT5A基因突變前后不同DNA序列進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)變化分析，并將STAT5A基因突變前后不同蛋白氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)變化分析。phyre2構(gòu)建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，將STAT5A與蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配，得到模擬的STAT5A蛋白三維結(jié)構(gòu)。RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析軟件：http：//www.genebee.msu.su/services/rna2_reduced.html。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析軟件：http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_server.html。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析軟件：http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA池的PCR產(chǎn)物測序

設(shè)計(jì)1對特異性引物擴(kuò)增出貴州本地3種山羊STAT5A基因目的序列共630 bp，見圖1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果與綿羊STAT5A基因DNA序列（GenBank登錄號(hào)：NC_019468.1）DNA序列基本吻合，可以確定為山羊STAT5A基因序列。BLAST分析共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs，以STAT5A基因第10外顯子第1位堿基計(jì)數(shù)為1，SNPs位點(diǎn)分別為C-32A、G+71A和G+158A，均為新發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)，詳見圖2。這些SNPs可能在不同山羊中普遍存在，需要擴(kuò)大山羊個(gè)體數(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。突變位點(diǎn)是否造成其生長性能差異也需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

2.2 SNPs等位基因頻率估算

利用MWSnap軟件分別測量3種山羊各SNPs等位基因峰高，并估算SNPs等位基因頻率，結(jié)果見表1。由表1可看出，不同品種山羊同一突變位點(diǎn)突變頻率近似，不同突變位點(diǎn)突變頻率相差較大。

2.3 STAT5A的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

突變前后STAT5A基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，SNP位點(diǎn)突變導(dǎo)致RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)顯著改變，詳見圖3。該突變導(dǎo)致RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能發(fā)生改變，由-914.4 kJ/mol變?yōu)?937.7 kJ/mol，影響RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可能影響后續(xù)蛋白質(zhì)翻譯過程。

2.4 突變前后STAT5A蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線SOPMA服務(wù)器預(yù)測黔北麻羊、貴州黑山羊和貴州白山羊STAT5A基因突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，突變前后，β轉(zhuǎn)角由1.76%增至2.02%，α螺旋由52.64%減少到52.27%，自由卷曲由34.51%上升到3501%，延伸鏈由11.08%下降為10.71%（表2）。

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測及突變分析對理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性有重要作用，采用同源比較建模原理，將突變前后氨基酸序列提交Phyre2三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器，結(jié)果詳見圖4。由圖4可以看出，多態(tài)性位點(diǎn)突變導(dǎo)致STAT5A蛋白三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生改變。其中β折疊鏈保持11%未變化，α螺旋保持50%未發(fā)生變化，混亂度則由27%上升到28%。

3 討論

STAT5A作為STAT家族中重要成員，具有多種生物學(xué)功能。STAT5A能夠顯著影響生物體乳腺發(fā)育功能、肝功能、妊娠反應(yīng)、免疫系統(tǒng)及腫瘤發(fā)生機(jī)制[16]，STAT5A與STAT5B共同影響了細(xì)胞增殖、生長、分化、凋亡，以及細(xì)胞周期的調(diào)控[17]。提高肉質(zhì)性能與生長性能一直是畜牧業(yè)品種選育的最終目標(biāo)，在家豬、小鼠、奶牛和嶗山奶羊上的研究都表明，STAT5A擁有影響動(dòng)物生長性能的能力[18-19]。因此，對STAT5A的深入研究有望改善貴州本地山羊個(gè)體生長性能較差的現(xiàn)狀，同時(shí)對加快品種選育有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)首次在貴州本地山羊STAT5A基因中鑒定得到SNP位點(diǎn)。其中G+71A突變，將丙氨酸（Ala）錯(cuò)義編碼為蘇氨酸（Thr）；C-32A和G+158A均在內(nèi)含子區(qū)，不參與氨基酸編碼。比較3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)不同山羊品種同一突變位點(diǎn)突變頻率近似，不同突變位點(diǎn)突變頻率相差較大，這一發(fā)現(xiàn)是否在其他山羊中也有不同，需要進(jìn)一步擴(kuò)大山羊的品種及數(shù)量進(jìn)行研究。突變前后STAT5A基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并影響到蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。為深入探究STAT5A基因?qū)ι窖蛏L性能的調(diào)控作用，有必要擴(kuò)大山羊數(shù)量，并分析上述多態(tài)性位點(diǎn)與山羊各項(xiàng)生長指標(biāo)關(guān)聯(lián)性，從而為山羊的選育工作以及整個(gè)STAT家族在山羊中的調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張?jiān)娳S，徐亞明，宋一超，等. Stat5： 多功能的轉(zhuǎn)錄因子[J]. 生命的化學(xué)，2012，32（2）： 180-184.

[2]Nevalainen M T，Gu L，Liao Z，et al. Pharmacological inhibition of JAK2-STAT5 signaling by JAK2 inhibitor AZD1480 potently suppresses growth of both primary and castrate-resistant prostate cancer[J]. Clinical Cancer Research，2013，19（20）： 5658-5674.

[3]Elisabetta C，Margherita G，Vito M，et al. JAK3/STAT5/6 pathway alterations are associated with immune deviation in CD8+ T cells in renal cell carcinoma patients [J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology，2010，2010：935764

[4]李海燕，裴 建，劉志丹，等. 針灸對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及Stat5-Foxp3通路影響[J]. 上海針灸雜志，2010（3）： 62-66.

[5]Song L，Schindler C. JAK-STAT signaling [M]//Bradshaw P A，Dennis E D. Regulation of organelle and cell compartment signaling：cell signaling collection. New York：Academic Press，2011：99-106.

[6]Krmer O H，Moriggl R. Acetylation and sumoylation control STAT5 activation antagonistically[J]. JAK-STAT，2012，1（3）：203-207.

[7]Vafaizadeh V，Klemmt P，Brendel C，et al. Mammary epithelial reconstitution with gene-modified stem cells assigns roles to STAT5 in luminal alveolar cell fate decisions，differentiation，involution，and mammary tumor formation[J]. Stem Cells，2010，28（5）： 928-938.

[8]Liang Q C，Xiong H，Zhao Z W，et al. Inhibition of transcription factor STAT5b suppresses proliferation，induces G1 cell cycle arrest and reduces tumor cell invasion in human glioblastoma multiforme cells[J]. Cancer Letters，2009，273（1）： 164-171.

[9]Xiong H，Su W Y，Liang Q C，et al. Inhibition of STAT5 induces G1 cell cycle arrest and reduces tumor cell invasion in human colorectal cancer cells [J]. Laboratory Investigation，2009，89（6）： 717-725.

[10]Yu J H，Zhu B M，Wickre M，et al. The transcription factors STAT5A and STAT5B negatively regulate cell proliferation through the activation of Cdkn2b and Cdkn1a expression[J]. Hepatology，2010，52（5）：1808-1818.

[11]方 瓊，李 娟，呂學(xué)斌，等. 家豬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子基因3、5a及5b的克隆、剪切變體鑒定及組織表達(dá)圖譜分析 [J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)，自然科學(xué)版，2012，49（4）：879-886.

[12]劉園峰，王桂芝，李秋梅，等. 嶗山奶山羊LEP和STAT5a基因?qū)γ谌楹蜕L性狀的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（18）：3946-3954.

[13]宋章會(huì). 貴州山羊生產(chǎn)現(xiàn)狀調(diào)查與發(fā)展對策[J]. 貴州畜牧獸醫(yī)，2007（5）：15-16.

[14]Sham P，Bader J S，Craig I，et al. DNA pooling： a tool for large-scale association studies [J]. Nature Reviews Genetics，2002，3（11）： 862-871.

[15]Suliman H B，Carraway M S，Piantadosi C A. Postlipopolysaccharide oxidative damage of mitochondrial DNA [J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2003，167（4）：570-579.

[16]陳煥珍，王 曉，李鳳英，等. JAK2/STAT5 通路在胰島對妊娠適應(yīng)中的作用[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（5）：555-559.

[17]Shain K H，Yarde D N，Meads M B，et al. β1 Integrin adhesion enhances IL-6-mediated STAT3 signaling in myeloma cells：implications for microenvironment influence on tumor survival and proliferation[J]. Cancer Research，2009，69（3）： 1009-1015.

[18]褚 敏，閻 萍，裴 杰，等. STATs 家族基因多態(tài)性在奶牛育種中的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（2）： 25-26.

[19]Huang Y L，Zhao F，Luo C C，et al. SOCS3-Mediated blockade reveals major contribution of JAK2/STAT5 signaling pathway to lactation and proliferation of dairy cow mammary epithelial cells in vitro[J]. Molecules，2013，18（10）： 12987-13002.