段文斌　金剛　代建國　張麗君　欒崇林　于化泓

摘要：Trizol法主要應(yīng)用于動植物RNA提取，由于其在提取RNA的過程中將DNA有效分離到有機(jī)相中，并且在有機(jī)相中DNA未被降解，因此本研究采用Trizol法提取具有細(xì)胞壁的普通小球藻的基因組DNA，發(fā)現(xiàn)提取得到的DNA純度和產(chǎn)率高，且DNA完整性好。經(jīng)檢測：D260 nm/D280 nm=1.86，平均得率為977 μg/g鮮質(zhì)量；瓊脂糖電泳檢測其條帶清晰，未發(fā)生降解。該方法具有簡單快速獲得高純度和高產(chǎn)率的小球藻基因組DNA的優(yōu)點。

關(guān)鍵詞：Trizol法；普通小球藻；DNA提取

中圖分類號：S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0033-02

Trizol法最早由Chomczynski等提出，用于提取細(xì)胞或組織中的總RNA[1]。經(jīng)過Trizol處理過的樣品，其總RNA、DNA及蛋白質(zhì)分別分布在上層水相、中間層、下層有機(jī)相。Trizol試劑中含有的苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，將細(xì)胞迅速破碎，并抑制釋放出來的核酸酶，同時能夠保持RNA、DNA的完整性，因此對RAN、DNA的同時提取純化十分有用[2]，大大節(jié)約試驗時間，提高試驗效率。小球藻（Chlorella vulgaris）作為一種單細(xì)胞綠藻，具有極強(qiáng)的光合自養(yǎng)能力；含有豐富的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素、核酸、食物纖維、葉綠素等，都是人體健康不可或缺的營養(yǎng)物。小球藻還生產(chǎn)多種生物活性物質(zhì)[3]。由于其脂類可以達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的10%～30%而被用于生產(chǎn)生物柴油[4-5]；通過轉(zhuǎn)基因小球藻可以被用來生產(chǎn)病毒抗體[6]；也發(fā)現(xiàn)小球藻具有抗菌活性[7]；小球藻可以治理重金屬、有機(jī)物以及氮磷污染[8]。因此，科研工作者開始對小球藻進(jìn)行深入研究。本研究嘗試使用Trizol法[9]提取小球藻基因組DNA，以期獲得簡單快速獲取高純度高產(chǎn)率基因組DNA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

普通小球藻購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物種保藏委員會海洋生物種質(zhì)庫，使用SE培養(yǎng)基培養(yǎng)，在三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度條件為2 000 lx，光暗周期設(shè)置為12 h/12 h；培養(yǎng)至對數(shù)后期取樣，試驗前將普通小球藻4 ℃黑暗處理24 h，將細(xì)胞內(nèi)儲存的淀粉消耗掉，將有利于DNA的提取。

1.2 試劑

Trizol Reagent 購自Invitrogen公司，氯仿、無水乙醇及異丙醇均為國產(chǎn)分析純，10 mol/L NH4Ac，TE（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值8.0），70%乙醇。

1.3 儀器

離心機(jī)：德國Eppendorf公司生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)：美國SYNGENE公司生產(chǎn)；核酸/蛋白分析儀；BECKMAN COULTER DU800；酶標(biāo)儀：Thermo Fisher SCIENTIFIC。

1.4 試驗步驟

將培養(yǎng)至對數(shù)期（D680 nm約為0.6[10]）的普通小球藻 300 mL 在1 500 g下離心5 min進(jìn)行收集并稱鮮質(zhì)量（500～600 mg），用新鮮培養(yǎng)基重懸浮1次，并再次離心收集；加入 5 mL Trizol試劑，吹打混勻，轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器研磨10 min；加入1.5 ml氯仿，混合均勻，在10 000 g、室溫下離心10 min，棄上層水相和中間變性蛋白層，吸取下層有機(jī)相至新的離心管中；加入等體積的無水乙醇沉淀DNA，-20 ℃靜置10 min，10 000 g、室溫下離心10 min；棄去上清，加入100 μL TE溶解管底的DNA沉淀，吹打混勻，加入40 μL 10 mol/L NH4Ac，混勻，4 ℃靜置10 min，10 000 g、室溫下離心10 min；吸取上清至新的離心管中，加入140 μL的異丙醇，混勻，-20 ℃放置10 min，12 000 g、室溫下離心10 min，棄去上清；加入70%的乙醇洗滌2次沉淀，離心，吸去離心管底的液體，在室溫下晾干5 min，加入80 μL TE溶液溶解DNA。

1.5 檢驗方法

使用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析以及核酸/蛋白分析儀測定其D260 nm、D280 nm及其比值；取5 μL溶有DNA的TE溶液稀釋400倍后進(jìn)行DNA濃度測定，并根據(jù)DNA濃度計算公式（DNA濃度=稀釋倍數(shù)×D260 nm×50/1000）計算出濃度值，計算結(jié)果單位為μg/μL。

2 結(jié)果與分析

使用Trizol法提取普通小球藻基因組DNA，其紫外吸收光譜在260 nm、280 nm波長處都有吸收峰，D260 nm/D280 nm值為1.86，表明該方法提取得到的DNA樣品沒有蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)，純度較高（表1）；并且具有高DNA產(chǎn)率，平均產(chǎn)率為977 μg/g鮮質(zhì)量）。從圖1可以看出，瓊脂糖凝膠電泳成像后的圖像中點樣孔處干凈，表明并沒有蛋白質(zhì)污染；DNA條帶單一，無拖尾及降解現(xiàn)象，說明所提取的DNA完整性好并且沒有RNA污染，電泳圖譜與21 kb位置相齊。

3 討論

由于小球藻具有很厚的細(xì)胞壁[11]，并且是單細(xì)胞真核藻類，細(xì)胞直徑3～8 μm，這些小球藻自身的特性給小球藻基因組DNA提取造成了不小困難，其細(xì)胞壁破碎和細(xì)胞溶解效果對基因組DNA的提取產(chǎn)率和效果具有較大影響；已有小球藻基因組DNA提取方法[12]，如任學(xué)艷等的SDS法[13]。SDS法試驗步驟較多，在研磨時由于沒有缺少合適的保護(hù)試劑，DNA容易被降解，影響到基因組DNA的產(chǎn)率和提取速度。CTAB法現(xiàn)在有較多的改進(jìn)方法[13-14]，但是基因組得率較低，張桂和等提取的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）得率為 695 μg/g鮮質(zhì)量[14]。陳穎等的超聲波法和纖維素酶法有RNA污染、DNA降解以及產(chǎn)率低的問題。本試驗采用加入Trizol后進(jìn)行玻漓勻漿器研磨，一是保證小球藻的充分破碎，對小球藻基因組DNA起到保護(hù)作用，是保證基因組DNA的得率的重要因素。

本試驗設(shè)計出了提取普通小球藻基因組DNA的方法；該方法穩(wěn)定可靠，并且具有簡單快速獲取高純度和高產(chǎn)率基因組DNA的優(yōu)點。該方法可以被用于分子生物學(xué)試驗作為常規(guī)提取普通小球藻基因組DNA的方法。

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