陳明輝++張志錄++楊雨華++佟偉霜++楊風嶺

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.028

摘要：采用目標起始密碼子多態(tài)性（SCoT）分子標記技術，研究紅豆杉18份種質的遺傳多樣性及種質間的遺傳關系，為紅豆杉資源的保護、利用以及遺傳育種提供依據(jù)。以18份紅豆杉種質資源為材料，從80條引物中篩選出19條重復性好、條帶清晰的引物進行PCR擴增，利用NTSYS-pc2.10e軟件對其擴增位點多態(tài)性進行分析。結果表明：19條引物共擴增出134條帶，其中97條具有多態(tài)性，多態(tài)性帶比率為72.39%。18個紅豆杉種質間遺傳相似系數(shù)在031～0.89之間，說明SCoT標記能夠揭示材料間較高的遺傳多樣性。利用UPGMA進行系統(tǒng)的聚類分析顯示，在相似系數(shù)0.53處可將18份紅豆杉資源分成兩大類；主坐標分析結果與聚類分析結果相一致。紅豆杉資源具有較豐富的遺傳多樣性，SCoT分子標記技術可有效地從分子水平揭示紅豆杉種質資源的遺傳背景和親緣關系。

關鍵詞：紅豆杉；目標起始密碼子多態(tài)性（SCoT）；遺傳多樣性；聚類分析；親緣關系

中圖分類號： S791.490.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0116-04

收稿日期：2015-09-25

基金項目：河南省科學攻關計劃 （編號：122102310652）；河南省環(huán)境科學重點學科建設項目（編號：Pxy-zdxk-2013003）。

作者簡介：陳明輝（1974—），男，河南平頂山人，博士，講師，主要從事植物生理生化及分子生物學研究。E-mail：cmh_abc@126.com。

通信作者：楊風玲，博士，教授，主要從事植物化學研究。E-mail：yangfl0001@163.com。紅豆杉[Taxus chinensis （Pilger） Rehd.]是第四世紀孑遺植物，已在地球上生活250萬年，是我國Ⅰ級重點保護野生植物，被稱為活化石[1-2]。1971年，美國科學家Wani等首次從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）樹皮中提取獲得抗癌藥物紫杉醇（Taxol）[3]，此后紅豆杉的藥用價值及其開發(fā)在我國廣泛開展。紅豆杉生長緩慢，極少成林，資源極其貧乏，而且紫杉醇含量僅為0.01%，由于紅豆杉資源遭到嚴重破壞而數(shù)量急劇下降，目前天然紅豆杉已處于嚴重瀕危狀態(tài)；所以，關于紅豆杉的繁殖、保護與利用已成為當前多個學科的研究熱點[4-11]。

目前紅豆杉分子標記研究取得了一定的成果。張雪梅等通過對南方紅豆杉18個居群進行了RFLP分析，發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉現(xiàn)在的遺傳結構可能源于居群的片段化效應[12]；Miao等利用SSR技術對14個居群的南方紅豆杉生境斷裂譜系和遺傳效應進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)生境斷裂導致了云南紅豆杉近親繁殖和種群分化[13]；吳瓊等利用基于紅豆杉轉錄組進行高通量測序進而發(fā)掘基因表達譜多態(tài)性標記[14]。但這些分子標記方法成本較高，操作復雜。目標起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，SCoT）分子標記技術是Collard等[15]開發(fā)的一種基于SPAR（單引物擴增反應）的目的基因分子標記新技術。SCoT依據(jù)植物基因中的ATG翻譯起始位點側翼序列的保守性，設計單引物并對基因組進行擴增[16]。SCoT標記結合ISSR標記和RAPD標記的優(yōu)點，操作簡單、成本低廉、多態(tài)性豐富，能有效地產生與性狀聯(lián)系的標記，是一種能跟蹤性狀的新的分子標記，有利于分子輔助育種[17-18]。該分子標記技術已被成功應用于花生[19]、龍眼[20]、芒果[21-22]等植物。本研究利用SCoT分子標記技術，從DNA水平研究了紅豆杉18份種質的遺傳多樣性及種質間的遺傳關系，以期對其親緣關系有更全面了解，為資源的保護、利用以及遺傳育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為2013—2014年采自不同地區(qū)的18份紅豆杉種質資源（表1），取其幼嫩葉片迅速置于液氮中速凍，帶回實驗室后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。試驗用?0對SCoT分子標記引物序列分別參照Collard等[15]和Luo等[22]設計的引物合成，所有引物由上海生工生物工程公司合成。dNTPs、DL2000 marker和TaqDNA聚合酶以及其他試劑均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取與檢測采用改良的CTAB法[23]提取DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，同時用島津BioSpec-nano型超微量分光光度計分析儀檢測DNA樣品質量和濃度。模板DNA稀釋至50 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SCoT-PCR擴增PCR擴增在ABI Veriti 梯度 PCR擴增儀上進行。采用20 μL的反應體系，其中含50 ng/μL模板DNA 1.0 μL、10×buffer（含Mg2+）2.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL、10 μmol/L dNTPs 0.5 μL，加ddH2O至20 μL。擴增程序為94 ℃預變性4 min；95 ℃變性50 s，復性退火（溫度隨引物而定）1 min，72 ℃ 延伸5 min，共36個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。擴增反應結束后，取5 μL擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為1×TAE，染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

SCoT產物按條帶的有無分別賦值，在相同遷移位置有帶記為1，無帶記為0，建立SCoT標記的0、1矩陣。把得到的0、1矩陣輸入NTSYS-pc2.10e計算遺傳相似性系數(shù)，并進行UPGMA聚類分析，構建樹狀圖，分析樣品間親緣關系。利用NTSYS-pc2.10e軟件將遺傳相似系數(shù)進行Dcenter數(shù)據(jù)轉化，求其特征量和特征向量，得到主坐標分析圖，進行主坐標分析。

2結果與分析

2.1SCoT擴增片段多態(tài)性分析

從80條引物中篩選出重復性好、擴增條帶清晰、多態(tài)性強的SCoT引物19條。利用這19條引物對18份紅豆杉種質資源進行擴增，每條引物可擴增出4～14條帶，平均多態(tài)性條帶為5～10條。擴增出的DNA帶的大小介于100～1 800 bp，其中代表性擴增圖譜見圖1。19條引物共擴增出134個DNA位點，其中97個位點具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為72.4%，說明供試的樣品遺傳多樣性比較豐富，多態(tài)性最高的是引物SCoT8和SCoT31，均達到100%，多態(tài)性最低的是引物SCoT17，為4286%（表2）。

2.2相似系數(shù)分析

用NTSYS-pc2.10e軟件計算紅豆杉種質間的Jaccard遺傳相似系數(shù)（表3）。表3結果表明：18個不同地區(qū)紅豆杉種質間的遺傳相似系數(shù)范圍在0.31～0.89之間。其中河南濟源黑龍溝的4號與河南濟源西坪村的5號相似系數(shù)為089，河南盧氏縣柴家溝的6號與河南盧氏縣毛河村的10號、甘肅徽縣北禪寺-2的14號的相似系數(shù)都為0.89，表明4號與5號、6號與10號、6號與14號的親緣關系較近。河南獲嘉縣的3號與重慶貓兒山的18號相似系數(shù)為最小，為031，說明3號與18號親緣關系最遠。

2.3聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA系統(tǒng)聚類法構建了紅豆杉試材間的遺傳關系聚類圖（圖2）。從聚類圖（圖2）來看，在相似系數(shù)0.53為閾值時，可將所有供試材料分為Ⅰ和Ⅱ兩大類。Ⅰ類包括4份材料，分別為神龍灣的1號、雙底村的2號、獲嘉縣的3號和平頂山-2的8號；Ⅱ類包括14份材料。在閾值約為0.61時，Ⅱ類又可分成Ⅱa和Ⅱb兩個亞類，其中Ⅱa亞類包括黑龍溝的4號、西坪村的5號、平頂山-1的7號、石鼓村的9號、宣恩縣的12號、貴陽的17號等6份材料；Ⅱb亞類包括柴家溝的6號、毛河村的10號、堯山的11號、北禪寺-1的13號、北禪寺-2的14號、天水的15號、兩當縣的16號、貓兒山的18號等8份材料。2.4主坐標分析

根據(jù)18份紅豆杉材料SCoT標記產生的數(shù)據(jù)進行主坐標分析，繪制三維散點圖（圖3）。從主坐標圖（圖3）可看出，18份紅豆杉材料被分為3組，第1組為1號、2號、3號和8號，位于主坐標圖的右方；第2組為4號、5號、7號、9號、12號和17號，位于主坐標圖的左方；第3組為6號、10號、11號、13號、14號、15號、16號和18號，分布在主坐標圖的中間偏下方。其中第2、3組距離相對較近，它們與第1組距離較遠，但第3組的15號與第1組距離較近。主坐標分析結果顯示，第1組紅豆杉與第2、3組紅豆杉在分子水平上表現(xiàn)出了較大的遺傳差異，主坐標分析可以從不同方向、不同層面更加直觀地顯示各材料間的關系。

3結論與討論

SCoT標記是一種基于翻譯起始位點的目標分子標記新技術，SCoT單引物在PCR反應中充當上下游引物的角色，從而使得引物結合位點之間的片段得以有效擴增，可獲得豐富的遺傳信息[24-25]，所以其在紅豆杉的遺傳多樣性和親緣關系分類上具有一定的可靠性。本研究將SCoT標記技術應用于紅豆杉材料的DNA多態(tài)性鑒定，在紅豆杉各材料內均檢測到較豐富的多態(tài)性，選用的19條SCoT引物具有很高的多態(tài)性，平均多態(tài)率達到73.19%。SCoT標記與功能基因相關，能在紅豆杉各材料之間檢測出較豐富的遺傳多態(tài)性，這與紅豆杉各資源間具有較豐富的多態(tài)性相一致，是進一步開發(fā)特定功能基因標記和建立分子標記輔助育種技術體系的基礎。

從本試驗聚類結果可以看出，在Ⅰ組的4個紅豆杉材料中，8號平頂山-2紅豆杉經(jīng)中國科學院植物研究所鑒定為東北紅豆杉，這4份紅豆杉材料聚為一個類群，說明它們親緣關系較近，同屬于東北紅豆杉體系；在第Ⅱ類的Ⅱa亞類中，有6份紅豆杉材料聚為一個類群，其中7號平頂山-1和9號石鼓村紅豆杉經(jīng)中國科學院植物研究所鑒定為南方紅豆杉，說明這個類群中的6份紅豆杉和南方紅豆杉具有密切的淵源，構成獨特的遺傳資源。在第Ⅱ類的Ⅱb亞類中，有8份紅豆杉材料聚為一個類群，其中6號柴家溝紅豆杉經(jīng)中國科學院植物研究所鑒定為中國紅豆杉，說明這個類群中的8份紅豆杉和秦嶺一帶的中國紅豆杉遺傳關系較近。

由以上分析可知，本試驗的SCoT分子標記數(shù)據(jù)在一定程度上反映了不同材料紅豆杉地理分布情況，說明地理因素對紅豆杉的親緣關系有很大影響；但是，有些地理距離遠而遺傳距離卻比較相近，這可能與其具有相似的環(huán)境條件和常年的引種有關。

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