袁曉晴　李磊　劉紅梅

摘要：為優(yōu)化癩葡萄中總黃酮的超聲波輔助提取工藝，通過單因素試驗(yàn)確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間、提取溫度、超聲功率5個(gè)提取工藝參數(shù)的最適水平范圍，并通過響應(yīng)面分析法（RSM）對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、提取溫度68 ℃、提取時(shí)間34 min，此條件下黃酮提取率為2.53%；驗(yàn)證試驗(yàn)表明，黃酮提取率為2.54%，與理論值相符合。

關(guān)鍵詞：癩葡萄；黃酮；超聲波輔助提取；響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0340-03

收稿日期：2015-01-08

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)計(jì)劃（編號(hào)：142102110177）。

作者簡(jiǎn)介：袁曉晴（1977—），女，江蘇泰州人，博士，副教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品深加工研究。E-mail：yxq_yrd@163.com。癩葡萄（Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.）別稱名金鈴子，是葫蘆科苦瓜屬（Momordica）的栽培種之一，其果實(shí)呈紡錘狀，果面呈不規(guī)則尖刺狀，長(zhǎng)約4 cm、寬約3 cm、單果質(zhì)量25～30 g，未成熟果實(shí)呈淺綠色，成熟后呈金黃色。目前關(guān)于癩葡萄中活性肽、皂苷的研究較多[1-2]，而對(duì)癩葡萄中黃酮的研究較少。癩葡萄的果實(shí)、葉中均富含黃酮，黃酮是一種強(qiáng)抗氧化劑，具有清除自由基、抗衰老、抗炎抑菌、降低膽固醇含量等多種生理功效[3-5]。

提取植物中總黃酮的傳統(tǒng)方法是熱回流提取法。近年來，隨著提取技術(shù)的不斷發(fā)展，許多學(xué)者使用超聲波輔助法分別從黃花菜[6]、馬齒莧[7]、苦蕎[8]等植物中提取總黃酮。超聲波提取是利用超聲波破碎細(xì)胞（空化）和強(qiáng)化傳質(zhì)（機(jī)械）作用，使溶劑分子滲透到組織細(xì)胞中與溶質(zhì)分子充分接觸，從而使細(xì)胞中的可溶成分更快釋放出來，該方法具有提取速度快、得率高、對(duì)熱不穩(wěn)定物質(zhì)破壞少等特點(diǎn)[9]。本研究通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮的工藝，以期為癩葡萄黃酮的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

癩葡萄采自南京市郊區(qū)，于70 ℃下烘干，冷卻后粉碎過40目篩，置于干燥器中保存?zhèn)溆?。蕓香苷購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；無水乙醇（AR）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

XA-1型高速萬能粉碎機(jī)（江蘇省姜堰市銀河實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品），WFJ7200型可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品），KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品），SHZ-D型循環(huán)水式真空泵（鄭州市長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精確稱取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液，搖勻并靜置6 min，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液，搖勻并靜置6 min，再加入 4.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，最后添加70%乙醇至刻度，搖勻并靜置15 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，到得蕓香苷濃度C（mg/mL）與吸光度D之間的回歸方程：

C=0.085 3D+0.002 5，r2 =0.998 8。

1.2.2癩葡萄總黃酮的提取及測(cè)定精確稱取脫脂后的癩葡萄粉1.0 g，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，按相應(yīng)條件進(jìn)行超聲波輔助提取，減壓抽濾并將濾液移至燒杯中待測(cè)。吸取1.0 mL待測(cè)液于10 mL容量瓶中，按照“1.2.1”節(jié)的方法測(cè)定黃酮質(zhì)量，黃酮提取率的計(jì)算公式為：

黃酮提取率=C×10×Vm×100%。

式中：C為總黃酮濃度（mg/mL）；m為癩葡萄粉質(zhì)量（mg）；V為癩葡萄提取液體積（mL）。

1.2.3單因素試驗(yàn)分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率對(duì)癩葡萄黃酮提取率的影響。試驗(yàn)中各考察因素的設(shè)定水平分別為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%；液固比（mL ∶g）10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1；提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃；提取時(shí)間10、20、30、40、50 min；超聲功率120、140、160、180、200 W。除考察因素外，其他因素的條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液固比30 mL ∶1 g、超聲功率180 W、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間30 min。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間為因素，采用Design-Expert軟件的中心組合試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平（表1）的中心旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于70%

時(shí)，癩葡萄黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高逐漸增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于70%時(shí)，黃酮提取率反而下降（圖1）?？梢姡掖俭w積分?jǐn)?shù)為70%左右時(shí)，溶劑與溶質(zhì)極性最相似；乙醇體積分?jǐn)?shù)過高則葉綠素等脂溶性物質(zhì)的溶出量增多，不利于黃酮的提純[10]，因此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.1.2液固比的影響當(dāng)液固比小于30 mL ∶1 g時(shí)，癩葡萄黃酮提取率隨液固比的增加顯著提高；當(dāng)液固比大于 30 mL ∶1 g 時(shí)，黃酮提取率的增幅降低（圖2）。液固比過高將增加溶劑成本，并加重后續(xù)的濃縮和干燥工作，因此確定液固比為30 mL ∶1 g。

2.1.3提取時(shí)間的影響在提取的前30 min內(nèi)，癩葡萄黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)顯著提高；當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，黃酮提取率的增幅降低（圖3）。為提高工作效率，確定提取時(shí)間為30 min。

2.1.4提取溫度的影響當(dāng)溫度低于70 ℃時(shí)，癩葡萄黃酮提取率隨溫度的升高顯著增大；當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，黃酮提取率反而降低（圖4）。溫度升高會(huì)加劇溶劑和溶質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)，有利于黃酮浸出；而溫度過高會(huì)增加其他物質(zhì)的溶出，并可能破壞黃酮活性成分，因此確定提取溫度為70 ℃。

2.1.5超聲功率的影響當(dāng)超聲功率低于180 W時(shí)，癩葡萄黃酮提取率隨超聲功率的增加而增大；當(dāng)超聲功率高于180 W時(shí)，黃酮提取率反而下降（圖5）。超聲功率增大則空化作用大，總黃酮傳質(zhì)速率高；超聲功率過高會(huì)使分子運(yùn)動(dòng)加劇、溶劑溫度升高，從而破壞黃酮組分并增加其他雜質(zhì)的溶出[11]，使癩葡萄黃酮提取率降低，因此確定超聲功率為180 W。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果確定超聲功率、液固比后，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）為變量，開展3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。本次提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)采取中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

2.2.2回歸模型的建立及方差分析以黃酮提取率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合，各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示：

Y=2.450+0.024X1+0.055X2+0.056X3-0.15X12-0.20X22-0.18X32+0.095X1X2-0.083X1X3-0.005X2X3。

對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析及顯著性評(píng)價(jià)（表3），此模型的P<0.000 1，表明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P值大于0.05，呈不顯著，表明該方程擬合3個(gè)參數(shù)與黃酮提取率之間的關(guān)系是可行的；較高的R2值（0.998 6）進(jìn)一步表明，試驗(yàn)方程式與實(shí)際數(shù)據(jù)之間具有非常好的擬合性。

回歸方程系數(shù)的顯著性分析表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間均對(duì)黃酮提取率具有顯著性影響（P<0.001），影響效果大小依次為：提取時(shí)間>提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)。這3個(gè)因素的二次項(xiàng)X12、X22、X33對(duì)黃酮提取率也有顯著性

影響（P<0.001）。

顯著（P<0.001），表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的交互作用對(duì)黃酮提取率的影響極顯著；X2X3項(xiàng)的回歸系數(shù)不顯著（P= 0.197 3），表明提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)黃酮提取率的影響不顯著。

提取條件對(duì)癩葡萄黃酮提取率影響的響應(yīng)面見圖6，其作用均為上凸曲面，表明本試驗(yàn)所選擇的區(qū)域范圍合理。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間的增大，黃酮提取率均呈先升高、后下降的變化趨勢(shì)，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響效果明顯。通過分析計(jì)算得到最佳提取條件： 乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、 提取溫度68 ℃、 提取時(shí)間34 min，此條件下黃酮提取率的理論值為2.53%。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行提取試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得癩葡萄黃酮提取率為2.54%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.4%，表明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3結(jié)論

為探討超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮的工藝條件，首先通過單因素試驗(yàn)確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間、提取表3回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)

溫度、超聲功率的最適水平范圍，再通過響應(yīng)面分析法對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、提取溫度 68 ℃、提取時(shí)間34 min，此條件下的黃酮提取率為253%。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，黃酮提取率為2.54%，與理論值相符合。

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