姚 靜，程 江，裴雪楓，王靜宇，王俊鋒，張學(xué)林，劉長(zhǎng)庭，袁 明（.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 8000；.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆石河子 8000；.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 00；.中國航天員科研訓(xùn)練中心，航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 0009；.解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京 008）

?

尾吊小鼠感染空間誘變大腸桿菌炎癥反應(yīng)增強(qiáng)

姚 靜1，程 江2，裴雪楓3，王靜宇4，王俊鋒5，張學(xué)林5，劉長(zhǎng)庭5，袁 明4
（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆石河子 832000；3.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；4.中國航天員科研訓(xùn)練中心，航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094；5.解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京 100853）

【摘要】目的 觀察空間誘變大腸桿菌感染尾吊模擬失重小鼠后炎癥反應(yīng)變化。方法 將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照、對(duì)照染菌、尾吊及尾吊染菌組，采用ELISA和RT-qPCR方法分別檢測(cè)小鼠血漿和腸道組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量及mRNA表達(dá)，HE染色觀察小腸組織形態(tài)學(xué)的改變。結(jié)果 血漿炎癥因子ELISA及腸道組織炎癥因子PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠血漿及腸道組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)均升高，且尾吊染菌組最為顯著（P＜0. 01或P＜0. 001）；小腸組織HE染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小腸粘膜均出現(xiàn)不同程度的損傷，且尾吊染菌組最為嚴(yán)重。結(jié)論 空間誘變大腸桿菌感染尾吊小鼠后可顯著升高血漿及腸道組織中炎癥因子表達(dá)，導(dǎo)致更嚴(yán)重的腸道黏膜屏障受損，提示尾吊模擬失重后感染空間誘變大腸桿菌可致機(jī)體的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。

【關(guān)鍵詞】空間誘變大腸桿菌；模擬失重；炎癥因子；腸道組織

隨著我國載人航天事業(yè)的發(fā)展，尤其是后續(xù)載人空間站任務(wù)的實(shí)施，需要航天員在太空環(huán)境停留的時(shí)間越來越長(zhǎng)。因此，對(duì)影響航天員健康的危險(xiǎn)因素評(píng)估及防護(hù)措施研究就顯得非常重要。航天員在飛行過程中可受到失重、輻射、超重、振動(dòng)、噪聲、心理緊張等多種不利因素的影響。這些因素會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，如出現(xiàn)空間運(yùn)動(dòng)病、肌肉萎縮、骨質(zhì)脫鈣、心血管功能失調(diào)等［1－2］。也有研究顯示，航天飛行可造成機(jī)體多項(xiàng)免疫學(xué)參數(shù)的改變，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低，使得機(jī)體受感染的機(jī)會(huì)大大增加［3］。同時(shí)在空間環(huán)境中，微生物出現(xiàn)毒力及耐藥性的改變，除了腐蝕航天設(shè)備，也對(duì)航天員的健康產(chǎn)生巨大威脅［4］。因此，研究失重/模擬失重下空間誘變菌感染所致炎癥反應(yīng)的機(jī)制，對(duì)于其有效防控具有重要意義。本研究采用前期篩選出的空間誘變大腸桿菌T1－13菌株，通過模擬失重小鼠感染模型，探討空間誘變菌感染模擬失重小鼠對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，體重18～22 g，周齡6～8周，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012－0001】，實(shí)驗(yàn)在中國航天員科研訓(xùn)練中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK（軍）2012－0020】開展，給予自由進(jìn)食、飲水、23±2℃環(huán)境溫度、每晝夜保持12 h光照與12 h黑暗交替循環(huán)條件下飼養(yǎng)。

1.1.2空間誘變大腸桿菌菌株空間誘變型大腸桿菌T1－13由解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科提供，該菌株搭載神舟十號(hào)飛船在軌飛行15 d，返回后測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)存在耐藥及毒力基因突變。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑和藥物炎癥因子ELISA檢測(cè)試劑盒，購自上海藍(lán)基生物科技有限公司；TRIzol試劑購自invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Green熒光定量試劑盒購自大連寶生物公司。

1.1.4儀器和設(shè)備伯樂Model680酶標(biāo)儀；電恒溫培養(yǎng)箱；離心機(jī)；eppendorf realplex PCR擴(kuò)增儀；EDTA抗凝真空采血管，一次性注射器，灌胃針等。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立及分組將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照（Con）、對(duì)照染菌（Con + T1－ 13）、尾吊（TS）及尾吊染菌組（TS + T1－13），每組10只。參照陳杰等［5］改良的方法對(duì)小鼠進(jìn)行頭低位30°尾部懸吊30 d后，將T1－13菌株配置成1. 2 ×108CFU/ mL溶度菌液，以灌胃法［6］對(duì)小鼠進(jìn)行接種，0. 2 mL/鼠。72 h后1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2ELISA方法檢測(cè)血漿炎癥因子試驗(yàn)當(dāng)天以1%戊巴比妥鈉0. 2 mL/鼠腹腔注射麻醉小鼠，消毒后于心臟搏動(dòng)最強(qiáng)處迅速進(jìn)針行心臟采血，離心分離血漿，按ELISA試劑盒操作說明書分別檢測(cè)血漿中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.2.3腸道組織形態(tài)學(xué)觀察心臟采血完畢后頸椎脫位處死小鼠，消毒后暴露腹腔，無菌剪取小腸約2 cm，清除腸內(nèi)容物后置于4%多聚甲醛中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色、封片，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4腸道組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè)TRIzol法提取小腸組織總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模版進(jìn)行real-time PCR分別檢測(cè)小腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)，引物序列見表1。設(shè)置反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；95℃15 s、60℃15 s、95℃15 s進(jìn)行溶解曲線分析。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism5. 0分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用ANOVA，兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)方法，P ＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物Tab. 1 Primer pairs for the real-time PCR

圖1　血漿中炎癥因子的含量Note.*P＜0. 05，**P＜0. 01，***P＜0. 001 vs Con；#P＜0. 05，##P＜0. 01，###P＜0. 001 vs TS；n =10.Fig. 1 Inflammatory cytokines production in plasma

2　結(jié)果

2.1血漿中炎癥因子的含量

與對(duì)照組相比，Con + T1－13組血漿中TNF-α （P＜0. 05）、IL-1β（P＜0. 001）、IL-6（P＜0. 001）含量均明顯升高；TS組血漿中IL-1β（P＜0. 05）和IL-6（P＜0. 001）含量明顯升高，TNF-α升高但無明顯差異；TS + T1－13組血漿中TNF-α（P＜0. 01）、IL-1β（P＜0. 001）、IL-6（P＜0. 001）含量均明顯升高，且升高最為顯著。與TS組相比，TS + T1-13組血漿中IL-1β（P＜0. 001）和IL-6（P＜0. 05）含量明顯升高，TNF-α升高但無明顯差異（圖1）。

2.2腸道組織形態(tài)學(xué)觀察

組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果可見，對(duì)照組小腸結(jié)構(gòu)沒有明顯變化，從黏膜層到漿膜層結(jié)構(gòu)完整，絨毛上皮細(xì)胞排列整齊（圖2A）。與對(duì)照組相比，Con + T1 －13組小腸絨毛頂端壞死脫落，有的地方整個(gè)絨毛壞死溶解，絨毛腫脹，固有層內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤，絨毛長(zhǎng)度變小，腸腔內(nèi)可見少量脫落的細(xì)胞碎片（圖2B）；TS組小腸絨毛上皮輕微增生（圖2C）；與Con + T1－13組相比，TS + T1－13組小腸絨毛出現(xiàn)類似病變，而且腸絨毛壞死情況較為嚴(yán)重，有的地方出現(xiàn)凝固性壞死，有的地方出現(xiàn)溶解性壞死，僅殘存部分結(jié)構(gòu)，腸腔內(nèi)出現(xiàn)大量壞死脫落的細(xì)胞碎片（圖2D）。

2.3腸道組織炎癥因子mRNA水平的表達(dá)

與對(duì)照組相比，Con + T1－13組小腸組織中TNF-α（P＜0. 05）、IL-1β（P＜0. 01）、IL-6（P＜0. 05）表達(dá)均明顯升高；TS組小腸組織中IL-6（P＜0. 05）表達(dá)明顯升高，TNF-α和IL-1β升高而無明顯差異；TS + T1-13組小腸組織中TNF-α（P＜0. 001）、IL-1β（P＜0. 01）、IL-6（P＜0. 001）表達(dá)均明顯升高，且升高最為顯著。與TS組相比，TS + T1 －13組小腸組織中TNF-α（P＜0. 01）、IL-1β（P＜0. 01）表達(dá)明顯升高，IL-6升高而無明顯差異（圖3）。

圖2　小腸組織病理改變（HE染色，×20）Note. A：Con；B：Con + T1－13；C：TS；D：TS + T1－13.（↑Necrosis in the top of intestinal villi；★Necrolysis of intestinal villi；☆cell debris from necrosis；▲Slight hyperplasia of chorioepithelium；?Coagulative necrosis）.Fig. 2 Histopathological changes in small intestine tissue（HE staining，×20）

圖3　腸道組織炎癥因子mRNA水平的表達(dá)Note.*P＜0. 05，**P＜0. 01，***P＜0. 001 vs Con；#P＜0. 05，##P＜0. 01，###P＜0. 001 vs TS；n =10.Fig. 3 mRNA expression level of inflammatory cytokines in intestinal tissue

3　討論

人類在進(jìn)行太空探索、執(zhí)行空間任務(wù)過程中，常會(huì)受到失重、超重、輻射、震動(dòng)、噪聲等多種不利因素的影響。大量航天醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，失重可造成航天員的免疫功能下降，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而程度加重，從而導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染的機(jī)率增加，成為嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)及影響空間任務(wù)的主要障礙［7］。同時(shí)，在載人航天活動(dòng)中，一些正常定植的細(xì)菌會(huì)隨著航天員或航空部件進(jìn)入太空，并在太空艙內(nèi)形成微生物群區(qū)。在特殊的空間環(huán)境下，微生物基因表達(dá)發(fā)生變化，毒力增加，生長(zhǎng)速度加快，耐藥性增強(qiáng)，使得機(jī)體受感染機(jī)會(huì)大大增加［4，8－9］。大腸桿菌是哺乳動(dòng)物常見的腸道正常寄生菌群，當(dāng)機(jī)體免疫力低下、腸道正常菌群紊亂時(shí)可機(jī)會(huì)性致病，引起機(jī)體相應(yīng)的腸道疾病。Raja Vukanti等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在模擬失重條件下，大腸桿菌活力和生長(zhǎng)速度明顯加快，細(xì)菌代謝產(chǎn)物明顯增多。

在一項(xiàng)模擬失重對(duì)小鼠T細(xì)胞亞群和某些細(xì)胞因子的影響的研究中發(fā)現(xiàn)［11］，尾部懸吊7 d后，小鼠CD8+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯降低，且IL-6活性呈增強(qiáng)趨勢(shì)，另外一項(xiàng)長(zhǎng)期飛行對(duì)機(jī)體免疫力影響的研究中發(fā)現(xiàn)［12］，不同時(shí)間的空間飛行后，血漿炎癥因子TNF-α、IL-1β均有不同程度的升高。我們參考既往已成功建立的多種地面模擬失重模型［13］，通過前期實(shí)驗(yàn)篩選出空間誘變型大腸桿菌T1-13，感染模擬失重小鼠，建立模擬失重小鼠腸道感染模型，在尾吊30 d后染菌3 d觀察血漿及腸道組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)三種炎癥因子在實(shí)驗(yàn)組中均升高，且TS + T1-13組最為顯著，說明模擬失重及空間致病菌確可使機(jī)體免疫力下降、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，且三種炎癥因子在全身感染性疾病和腸道黏膜免疫中均發(fā)揮重要作用。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種功能的細(xì)胞因子，在炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中首先被激活，并誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、IL-8等的產(chǎn)生。當(dāng)細(xì)菌感染時(shí)，TNF-α水平迅速升高，但其高峰期時(shí)間較IL-6短，并很快下降至正常水平［14］。在一項(xiàng)長(zhǎng)期飛行的研究中發(fā)現(xiàn)，血漿中TNF-α在飛行中升高，飛行后較飛行前無明顯改變［12］。我們實(shí)驗(yàn)顯示，TS組TNF-α表達(dá)較對(duì)照組雖有升高，但不明顯，認(rèn)為與上述所述TNF-α表達(dá)峰值時(shí)間有關(guān)。另外，有研究表明暴露于不同時(shí)間的空間飛行，機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答效應(yīng)不盡相同，且免疫功能的恢復(fù)與飛行后返回地面的時(shí)間可能相關(guān)［3，12］。

關(guān)于失重對(duì)機(jī)體消化系統(tǒng)的影響，有研究人員利用尾部懸吊大鼠模型，觀察模擬失重14 d和21 d小腸組織結(jié)構(gòu)，光鏡和電鏡結(jié)果均顯示小腸黏膜絨毛和微絨毛稀少，變短變寬，表面積減少，小腸粘膜緊密連接蛋白表達(dá)減少，黏膜通透性增加，推測(cè)小腸粘膜微觀結(jié)構(gòu)的改變可能是航天員在航天飛行中出現(xiàn)消化系統(tǒng)不良癥狀的重要原因之一［15］。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)不同程度的厭食、消瘦、精神萎靡，進(jìn)一步觀察小腸組織結(jié)構(gòu)，證實(shí)了模擬失重會(huì)改變腸道黏膜屏障的觀點(diǎn)［16］。另外在失重不良刺激作用下，胃腸道應(yīng)激反應(yīng)、蠕動(dòng)紊亂、血管床淤血、微生態(tài)失調(diào)等一系列因素造成腸黏膜受損，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物由門靜脈入血，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)。

綜上所述，空間誘變菌及模擬失重可使小鼠血漿及腸道組織中炎癥因子表達(dá)升高、腸道黏膜屏障受損，提示空間環(huán)境較地面更易使機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Hirayanagi K，Iwase S，Kamiya A，et al. Functional Changes in Autonomic Nervous System and Baroreceptor Reflex Induced by 14 Days of 6 Degrees Head-Down Bed Rest［J］. Eur J Appl Physiol，2004. 92（1－2）：160－167.

［2］ Herault S，F(xiàn)omina G，Alferova I，et al. Cardiac，Arterial and Venous Adaptation to Weightlessness During 6-Month MIR Spaceflights with and without Thigh Cuffs（Bracelets）［J］. Eur J Appl Physiol，2000. 81（5）：384－390.

［3］ Crucian B，Stowe R，Quiriarte H，et al. Monocyte Phenotype and Cytokine Production Profiles are Dysregulated by Short-Duration Spaceflight［J］. Aviat Space Environ Med，2011. 82 （9）：857－862.

［4］ Wilson JW，Ott CM，Honer zu Bentrup K，et al. Space Flight Alters Bacterial Gene Expression and Virulence and Reveals a Role for Global Regulator Hfq［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2007. 104（41）：16299－16304.

［5］ 陳杰，馬進(jìn)，丁兆平，等.一種模擬長(zhǎng)期失重影響的大鼠尾部懸吊模型［J］.空間科學(xué)學(xué)報(bào)，1993（02）：159－162.

［6］ 陳超，鄭成中.致病性大腸桿菌胃腸感染小鼠模型血漿Th1、Th2、Th17淋巴細(xì)胞因子變化及意義［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013（19）：37－39.

［7］ Crucian B，Stowe R，Mehta S，et al. Immune System Dysregulation Occurs During Short Duration Spaceflight on Board the Space Shuttle［J］. J Clin Immunol，2013. 33（2）：456 －465.

［8］ Rosenzweig JA，Abogunde O，Thomas K，et al. Spaceflight and Modeled Microgravity Effects on Microbial Growth and Virulence ［J］. Appl Microbiol Biotechnol，2010. 85（4）：885－891.

［9］ Charles D. Science on the Shuttle. Nasa's Busload of Science ［J］. Science，2011. 333（6038）：28－29.

［10］ Vukanti R，Model MA，Leff LG. Effect of Modeled Reduced Gravity Conditions on Bacterial Morphology and Physiology［J］. BMC Microbiol，2012. 12：4.

［11］ Wen XL，Yang GH，Wang T，et al. Effects of Simulated Weightlessness on T Cell Subpopulations and Activity of IL－2 and IL－6 in Mice［J］. Space Med Med Eng（Beijing），2001. 14（1）：60－62.

［12］ Crucian BE，Zwart SR，Mehta S，et al. Plasma Cytokine Concentrations Indicate That in vivo Hormonal Regulation of Immunity is Altered During Long-Duration Spaceflight［J］. J Interferon Cytokine Res，2014. 34（10）：778－786.

［13］ 董麗，王瓊，劉新民，等.地面模擬失重實(shí)驗(yàn)方法概況［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013，21（05）：90－94.

［14］ Panero A，Pacifico L，Rossi N，et al. Interleukin 6 in Neonates with Early and Late Onset Infection［J］. Pediatr Infect Dis J，1997. 16（4）：370－375.

［15］ 陳英，楊春敏，毛高平，等.模擬失重對(duì)大鼠小腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)的影響［J］.航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2011（05）：327－331.

［16］ 白樹民，黃紀(jì)明，朱德兵，等.模擬失重對(duì)大鼠腸道菌群影響的研究［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2001（06）：20－21.

〔修回日期〕2016－01－25

Increased inflammatory reaction in tail-suspension mice infected by E. coli in spaceglight

YAO Jing1，CHENG Jiang2，PEI Xue-feng3，WANG Jing-yu4，WANG Jun-feng5，ZHANG Xue-lin5，LIU Chang-ting5，YUAN Ming4
（1. The Medical College of Shihezi University，Xinjiang Shihezi 832000，China；2. Department of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Shihezi Medical University，Xinjiang Shihezi 832000，China；3. Liaoning Medical College，Liaoning Jinzhou 121001，China；4. The Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals and Application，China Astronaut Research and Training Center，Beijing 100094，China；5. Nanlou Respiratory Diseases Department，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China）

【Abstract】Objective To observe the changes of inflammatory reaction in tail-suspension mice after infected by E. coli in spaceflight. Methods 40 C57BL/6 mice were randomly divided into four groups：control group（Con），control + E. coli T1-13 group（Con + T1-13），tail suspension group（TS），tail suspension + E. coli T1-13 group（TS + T1-13）. The inflammatory cytokines TNF-α，IL-1β and IL-6 production in plasma and mRNA level in intestinal tissue were detected by ELISA and RT-qPCR，and HE staining was used to represent the morphology changes in small intestine tissue. Results Compared with the control group，the expression of inflammatory cytokines in plasma and intestinal tissue of allexperimental groups were increased，and the TS + T1-13 group was most significant（P＜0. 01 or P＜0. 001）. HE staining showed that the small intestine mucosa in the experimental groups were damaged in different degrees，and the damage of TS + T1-13 group was most serious. Conclusions The E. coli from spaceflight increased significantly the expression of inflammatory cytokines in plasma and intestinal tissue from infected tail-suspension mice，and brought more serious damages to the small intestinal mucosal barrier，which suggested that the inflammatory reaction would be increased in tailsuspension mice infected by E. coli from spaceflight.

【Key words】Space mutation E. coli；Simulated microgravity；Inflammatory cytokines；Intestinal tissue

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）03-0001-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 001

［基金項(xiàng)目］國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2014CB744404）。

［作者簡(jiǎn)介］姚靜（1988－），女，碩士，研究方向：臨床分子生物學(xué)診斷，E-mail：yaojing_hnzz@163. com。

［通訊作者］袁明（1977－），男，副研究員，博士，研究方向：空間生物學(xué)，E-mail：yuanming7711@ aliyun. com；程江（1963－），男，教授，碩士，研究方向：實(shí)驗(yàn)室管理及分子生物學(xué)，E-mail：chengjiang1980@ sina. com。