付 瑞，李曉波，王淑菁，王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，岳秉飛，賀爭(zhēng)鳴（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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H-1細(xì)小病毒抗體ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

付 瑞，李曉波，王淑菁，王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，岳秉飛，賀爭(zhēng)鳴
（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【摘要】目的 建立H-1細(xì)小病毒抗體的ELISA檢測(cè)方法，并進(jìn)行初步應(yīng)用。方法 采用大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6培養(yǎng)大鼠H-1細(xì)小病毒，制備包被抗原，采用純化后抗原建立該病毒的ELISA檢測(cè)方法；將建立的方法與國(guó)外同類試劑盒進(jìn)行比對(duì)，考察該方法的特異性和靈敏度。同時(shí)，應(yīng)用該方法對(duì)35份大鼠血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果所建立的方法可檢測(cè)出稀釋1280倍的陽(yáng)性血清；與犬細(xì)小病毒、小鼠微小病毒和豬細(xì)小病毒陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng)；與大鼠細(xì)小KRV病毒有交叉反應(yīng)；對(duì)35份大鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，與國(guó)外同類試劑盒結(jié)果一致。結(jié)論 所建立的H-1細(xì)小病毒ELISA檢測(cè)方法具有良好的種屬特異性和靈敏度，可用于大鼠血清中H-1細(xì)小病毒抗體檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】H-1細(xì)小病毒；ELISA；抗體檢測(cè)

大鼠細(xì)小病毒（Rat parvovirus，RPV）是對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠危害最為嚴(yán)重的病毒之一。成年大鼠感染多無(wú)臨床癥狀，免疫抑制等因素可激發(fā)本病。RPV還可污染腫瘤移植物和細(xì)胞系，對(duì)實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生嚴(yán)重干擾［1］。Toolan［2］從經(jīng)大鼠傳代的人腫瘤細(xì)胞系（HEP-1）分離到第2株大鼠細(xì)小病毒，通常稱為H-1細(xì)小病毒，又稱Toolan病毒。H-1細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科，其天然宿主為大鼠，病毒粒子直徑為20～25 nm，為無(wú)囊膜單鏈DNA病毒，其核酸約為5100 nt［3］。

我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 14922. 2－2011）規(guī)定大鼠細(xì)小病毒KRV和H-1株為SPF實(shí)驗(yàn)大鼠病毒的必檢項(xiàng)目。本研究采用可傳代的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6培養(yǎng)H-1細(xì)小病毒［4］，從而建立了H-1細(xì)小病毒抗體的ELISA檢測(cè)方法。

1　材料和方法

1.1毒株和細(xì)胞

H-1細(xì)小病毒購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保存中心（ATCC，VR-356），大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2其它試劑及樣品

商品化H-1 ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)XpressBio公司；豬細(xì)小病毒、小鼠微小病毒和犬細(xì)小病毒陰陽(yáng)對(duì)照血清均為科室制備保存；山羊抗大鼠IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗豬IgGHRP和山羊抗犬IgG-HRP均購(gòu)自KPL公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；35份清潔級(jí)與SPF級(jí)大鼠血清樣本來(lái)自北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)督檢驗(yàn)收集樣品。

1.3病毒培養(yǎng)

將C6細(xì)胞按照6×104個(gè)/ mL的濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，采用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)及培養(yǎng)6 h后將H-1病毒液以0. 02 MOI的比例加入培養(yǎng)瓶中。置含有5%二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄去瓶中培養(yǎng)液，加入等體積的含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，完全病變的病毒凍存于－70℃保存。

1.4病毒滴定

將C6細(xì)胞按照6×104個(gè)/ mL的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)6 h后將H-1病毒液以10－1～10－11作系列倍比稀釋，依次加入培養(yǎng)有C6細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1～11列），每個(gè)稀釋度接種1列（8孔），第12列不加病毒，作為細(xì)胞對(duì)照。置含有5%二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱中觀察10 d，記錄結(jié)果。

1.5抗原的制備及純化

正?？乖篊6細(xì)胞按照6×104個(gè)/ mL的濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待長(zhǎng)滿單層后，用10%ATV常規(guī)法消化，PBS洗滌，1000 r/ min離心10 min，沉淀溶于適量PBS凍融3次后，超聲破碎，10000 r/ min離心30 min，取上清，測(cè)定蛋白含量。分裝后作為正?？乖瓋龃嬗冢?0℃?zhèn)溆谩?/p>

特異抗原：收獲H-1病毒，于4℃，10000 r/ min離心1 h，取上清于4℃，40000 r/ min離心3 h，收集沉淀于適量PBS中。超聲破碎后，再經(jīng)20%蔗糖離心，采用紫外分光光度法測(cè)定抗原蛋白含量。分裝后作為正常抗原凍存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6毒種的PCR鑒定

常規(guī)方法提取病毒DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳后應(yīng)能觀察到183 bp的可見目的條帶。PCR產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。

1.7判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)選擇OD490來(lái)讀取吸光度。在陰、陽(yáng)對(duì)照血清成立的情況下，待檢血清特異抗原孔A值≥0. 2、待檢血清特異抗原孔A值/陰性對(duì)照特異抗原孔A值（P/ N值）≥2. 1，判為陽(yáng)性。

1.8正?？乖c特異抗原、酶結(jié)合物最佳工作濃度的確定

將陽(yáng)性血清、陰性血清、包被抗原、HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG進(jìn)行系列倍比稀釋，根據(jù)方陣滴定法確定試驗(yàn)的最適工作條件。

1.9精密性測(cè)定

取陰性血清與陽(yáng)性血清各一份，1∶40稀釋后，各用一塊純化后H-1細(xì)小病毒包被的96孔板測(cè)定。得到的結(jié)果分別計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算板內(nèi)變異系數(shù)（CV）。

1.10特異性測(cè)定

用已建立的ELISA法和XpressBio公司檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)大鼠細(xì)小KRV病毒、小鼠微小病毒（MVM）、犬細(xì)小病毒（CPV）和豬細(xì)小病毒（PPV）陰、陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)H-1病毒標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照。

1.11重復(fù)性測(cè)定

取純化后H-1抗原包被的96孔板，分別對(duì)20份血清（其中陰性血清15份，陽(yáng)性血清5份）重復(fù)測(cè)定三次，計(jì)算結(jié)果的符合率。

1.12穩(wěn)定性測(cè)定

用純化后H-1抗原包被96孔ELISA板11塊，其中一塊保存于4℃，其余10塊置于37℃，分別于第1－10天每天取出一塊放4℃保存，同時(shí)檢測(cè)同一批15份陰性血清和5份陽(yáng)性血清。

1.13敏感性測(cè)定

將H－1陽(yáng)性對(duì)照血清1∶40至1∶2560系列稀釋后，用所建立的ELISA方法檢測(cè)，以確定所建立方法的敏感性。

1.14與商品化試劑盒的比較

用購(gòu)自XpressBio公司的Toolan’s H-1 Virus Rat檢測(cè)試劑盒與本研究所建立的ELISA方法同時(shí)檢測(cè)20份大鼠血清（其中15份陰性血清，5份陽(yáng)性血清），對(duì)所建立的ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.15H-1ELISA抗體檢測(cè)方法的應(yīng)用

用所建立的方法檢測(cè)來(lái)自北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)督檢驗(yàn)的35份大鼠血清。

2　結(jié)果

2.1病毒培養(yǎng)結(jié)果

病毒經(jīng)C6細(xì)胞培養(yǎng)72 h后完全病變，正常細(xì)胞對(duì)照與病變細(xì)胞結(jié)果見圖1與圖2。

圖1　正常C6細(xì)胞培養(yǎng)72 h后Fig. 1 C6 cell was cultured 72 h

圖2　H-1培養(yǎng)72 h后Fig. 2 H-1 virus was cultured 72 h

2.2病毒滴定結(jié)果

采用C6細(xì)胞96孔細(xì)胞病變法對(duì)H-1細(xì)小病毒進(jìn)行滴定，重復(fù)測(cè)定二次滴定結(jié)果按照Karber法計(jì)算。（Karber法是計(jì)算病毒感染力的一種方法，其公式為：LgTCID50= L-d（S-0. 5）其中：L =最高稀釋度的對(duì)數(shù)；d =稀釋對(duì)數(shù)之間的差；s =陽(yáng)性孔比率總和），H-1細(xì)小病毒滴度為6. 5 LgTCID50/0. 1 mL。

2.3抗原的制備和純化

分別制備和純化C6細(xì)胞和H-1細(xì)小病毒作為正?？乖吞禺惪乖?，采用分光光度法測(cè)定正?？乖吞禺惪乖臐舛龋渲蠧6細(xì)胞正常抗原濃度為0. 509 mg/ mL；H-1細(xì)小病毒特異抗原濃度為6. 597 mg/ mL。

2.4毒種的PCR鑒定

用建立的PCR方法分別擴(kuò)增H-1、KRV、小鼠微小病毒（MVM）、豬細(xì)小病毒（PPV），結(jié)果顯示，在以H-1為模板時(shí)出現(xiàn)183 bp的單一目的條帶，以KRV、小鼠微小病毒（MVM）、豬細(xì)小病毒（PPV）為模板時(shí)無(wú)目的條帶出現(xiàn)（圖3）。

圖3　H-1細(xì)小病毒株P(guān)CR特異性結(jié)果Note：M：100 bp marker；1：H-1；2：KRV；3：MVM；4：PPV.Fig. 3 Specificity of H-1 Virus PCR

以H-1 DNA為模板，能擴(kuò)增到183 bp的可見目的條帶，PCR產(chǎn)物送生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，與H-1細(xì)小病毒同源性達(dá)到97%。

2.5最佳工作條件確定

采用棋盤滴定法確定H-1細(xì)小病毒ELISA方法中正?？乖?、特異抗原及HRP標(biāo)記山羊抗大鼠IgG最佳工作濃度，其中正常抗原工作濃度為0. 2 μg/ mL，特異抗原工作濃度為5 μg/ mL，HRP標(biāo)記山羊抗大鼠IgG工作稀釋度為1∶10000。

2.6精密性測(cè)定

取陰性血清與陽(yáng)性血清各一份，1∶40稀釋后，各用一塊純化后H-1細(xì)小病毒包被的96孔板測(cè)定。得到的結(jié)果分別計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算板內(nèi)變異系數(shù)（CV），經(jīng)計(jì)算，陰性血清與陽(yáng)性血清CV值均小于15%（表1）。

表1　H-1細(xì)小病毒ELISA方法精密性檢測(cè)Tab. 1 The precision of ELISA method for H-1 parvovirus

2.7特異性測(cè)定

用已建立的ELISA法和XpressBio公司的H-1檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)大鼠細(xì)小KRV病毒、小鼠微小病毒（MVM）、犬細(xì)小病毒（CPV）和豬細(xì)小病毒（PPV）陰、陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)H-1病毒標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照。結(jié)果顯示H-1細(xì)小病毒和KRV病毒陽(yáng)性血清檢測(cè)為陽(yáng)性，其余病毒陰性及陽(yáng)性血清檢測(cè)均為陰性，所建立的H-1細(xì)小病毒ELISA方法有良好的種屬特異性（表2）。

表2　H-1細(xì)小病毒ELISA方法特異性試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 The specificity of ELISA method for H-1 parvovirus

2.8檢測(cè)方法重復(fù)性測(cè)定

將15份陰性血清和5份陽(yáng)性血清1：40稀釋后，重復(fù)測(cè)定三次，經(jīng)計(jì)算分析三次測(cè)定的總符合率為100%。三次測(cè)定陰性血清與陽(yáng)性血清各自的符合率見表3.

表3　H-1細(xì)小病毒ELISA方法重復(fù)性檢測(cè)Tab. 3 Repeatability of ELISA method for H-1 parvovirus

2.9檢測(cè)方法穩(wěn)定性測(cè)定

37℃放置0～10 d的H-1細(xì)小病毒包被11塊抗原包被板，同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性血清5份，陰性血清15份。比較檢測(cè)結(jié)果的P/ N值（表4）。其中陰性血清P/ N值均小于2. 1，陽(yáng)性血清P/ N值均大于2. 1，符合判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.10檢測(cè)方法敏感性測(cè)定

用所建立的ELISA方法檢測(cè)經(jīng)倍比稀釋的陽(yáng)性血清，以確定該方法的敏感性（表5）。經(jīng)檢測(cè)，陽(yáng)性血清進(jìn)行1280倍稀釋后P/ N值仍大于2. 1，該方法敏感性為1∶1280。

2.11與商品化試劑盒的比較

用所建立的H-1細(xì)小病毒ELISA檢測(cè)方法與XpressBio公司的H-1 ELISA檢測(cè)試劑盒同時(shí)對(duì)15份陰性血清和5份陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示所建立的方法與商品化試劑盒的符合率為100%（表6）。

2.12H-1細(xì)小病毒ELISA檢測(cè)方法的初步應(yīng)用

采用建立的H-1細(xì)小病毒ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)XpressBio公司H-1試劑盒檢測(cè)為陰性的大鼠血清35份，經(jīng)檢測(cè)均為陰性。

表4　H-1細(xì)小病毒ELISA方法穩(wěn)定性檢測(cè)Tab. 4 Stability of ELISA method for H-1 parvovirus

表5　H-1細(xì)小病毒ELISA方法敏感性測(cè)定Tab. 5 Sensitivity of ELISA method for H-1 parvovirus

表6　兩種ELISA檢測(cè)試劑結(jié)果比較Tab. 6 Comparison of two kinds of ELISA methods

3　討論

GB / T 14926. 31－2001中建議采用大鼠胚胎原代細(xì)胞（primary rat embryo cells，RE）培養(yǎng)H-1病毒。用RE細(xì)胞培養(yǎng)H-1病毒，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、易污染，并需要使用大量懷孕大鼠，在給H-1病毒的培養(yǎng)帶來(lái)了諸多困難的同時(shí)也不符合動(dòng)物福利的原則。劉先菊等［4］報(bào)導(dǎo)可通過(guò)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6可傳代培養(yǎng)H-1細(xì)小病毒，為該病毒的大規(guī)模培養(yǎng)與制備提供了基礎(chǔ)。

本研究首次建立了通過(guò)傳代細(xì)胞培養(yǎng)H-1細(xì)小病毒的ELISA檢測(cè)方法。采用大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6對(duì)H-1細(xì)小病毒進(jìn)行培養(yǎng)，得到病毒滴度為為6. 5LgTCID50/0. 1 mL的病毒。該病毒經(jīng)PCR方法驗(yàn)證為H-1細(xì)小病毒，與NCBI的序列進(jìn)行比對(duì)，符合率為97%。通過(guò)對(duì)獲得的病毒進(jìn)行超速離心和蔗糖梯度密度離心進(jìn)行純化，得到純化的H-1細(xì)小病毒抗原，抗原濃度為6. 597 mg/ mL。用該抗原作為包被抗原，建立H-1細(xì)小病毒的全病毒ELISA抗體檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)方法的敏感性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、特異性和精確性進(jìn)行驗(yàn)證，確定該方法可檢測(cè)出大于1：1280稀釋的陽(yáng)性血清，37℃放置10 d不影響其檢測(cè)效果。所建立的檢測(cè)方法與XpressBio公司的H-1檢測(cè)試劑盒均與犬細(xì)小病毒、豬細(xì)小病毒和小鼠細(xì)小病毒陽(yáng)性血清間無(wú)交叉反應(yīng)，但兩種方法均與大鼠細(xì)小病毒KRV有交叉反應(yīng)，經(jīng)NCBI比對(duì)，H-1細(xì)小病毒與大鼠細(xì)小病毒KRV的序列同源性達(dá)到90%，其中兩種病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS-1同源性為99%，非結(jié)構(gòu)蛋白NS-2同源性為98%，結(jié)構(gòu)蛋白VP-1同源性為81%，結(jié)構(gòu)蛋白VP-2同源性為78%，通過(guò)序列比對(duì)說(shuō)明H-1細(xì)小病毒和KRV細(xì)小病毒之間具有交叉抗原，需要針對(duì)兩種病毒結(jié)構(gòu)蛋白的差異分別建立檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行區(qū)分，有待進(jìn)一步研究。

本方法的建立，可有效補(bǔ)充國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中H-1細(xì)小病毒檢測(cè)方法，并可代替國(guó)外同類試劑盒對(duì)大鼠血清中H-1細(xì)小病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 田克恭.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒性疾?。跰］.北京：農(nóng)業(yè)出版社. 1992：126－132.

［2］ 田克恭，賀爭(zhēng)鳴，劉群，等.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫病學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社. 2014：205.

［3］ Karsten Geletneky，Andreas D. Hartkopf，Robert Krempien，et al. Therapeutic implications of the enhanced short and longtermcytotoxicity of radiation treatment followed by oncolytic parvovirusH－1 infection in high-grade glioma cells［J］. Bioengineered Bugs，2010，1：429－433.

［4］ 劉先菊，佟巍，張麗芳，等.大鼠細(xì)小病毒H－1株培養(yǎng)方法的建立［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2011，19：495－498.

〔修回日期〕2015－11－08

Establishment and application of ELISA method for H-1 parvovirus

FU Rui，LI Xiao-bo，WANG Shu-jing，WANG Ji，WEI Li，GONG Wei，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To establish ELISA method for H-1 parvovirus，and to apply it in detection. Method Cultured the H-1 parvovirus in rat glioma cell line C6，prepared the viral antigen for coating. Used the purified viral antigen to establish the ELISA method，and compared the ELISA method with the ELISA kit from XpressBio company. Then applied the ELISA method in detection of 35 rat serums. Results The positive serum which be diluted to 1280 can be detected by the ELISA method，there have not cross reaction with positive serum of CPV，MVM and PPV，but there has cross reaction with KRV. 35 pieces of rat serums were detected by the ELISA method，they were all negative，the results were consistent with the kit from XpressBio company. Conclusions The sensitivity and species specificity of the ELISA method for H-1 parvovirus were suitable，the method can be used in detection of H-1 parvovirus in rat serum.

【Key words】H-1 parvovirus；ELISA；Detection of antibody

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）03-0075-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 015

［基金項(xiàng)目］國(guó)家科技支撐計(jì)劃“實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物病原分子生物學(xué)快速檢測(cè)新技術(shù)研究與應(yīng)用”（2015BAI07B02）。

［作者簡(jiǎn)介］付瑞（1978－），男，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)，Email：furui78@126. com。

［通訊作者］賀爭(zhēng)鳴（1957－），男，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)，Email：zhengminghe57@163. com。