李龍衛(wèi)，王艷云，陳 琦，王亞萍，韓 璐（大連醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院暨大連市婦幼保健院，遼寧大連 116033）

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提高大鼠子宮內(nèi)膜異位癥建模成功率的新方法

李龍衛(wèi)，王艷云，陳 琦，王亞萍，韓 璐
（大連醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院暨大連市婦幼保健院，遼寧大連 116033）

【摘要】目的 為子宮內(nèi)膜異位癥治療新方法的研究提供理想的動(dòng)物模型。方法 取64只性成熟、未孕、動(dòng)情周期規(guī)律的SD大鼠，于動(dòng)情期在腹膜、皮下利用“刀劃法”行自體子宮內(nèi)膜移植，術(shù)后4周比較兩移植部位建模情況。結(jié)果 大鼠動(dòng)情期自體子宮內(nèi)膜移植總體成功率為93. 3%，其中腹膜移植成功率為51. 7%，皮下移植成功率為88. 3%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；比較兩部位異位病灶的體積，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 利用“刀劃法”建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型成功率較高，皮下移植比腹膜移植成功率高。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥；模型，動(dòng)物；動(dòng)情期；嚙齒

子宮內(nèi)膜異位癥是女性常見良性疾病，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，因其在臨床行為學(xué)上具有類似惡性腫瘤的種植、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，影響育齡女性的心理健康及生活質(zhì)量［1］，使得內(nèi)異癥成為婦科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題之一，減少內(nèi)異癥復(fù)發(fā)的新藥也不斷研發(fā)中，而良好的子宮內(nèi)膜異位癥模型有助于新的治療方法的研究。因此，此研究旨在探索一種操作簡(jiǎn)單、成功率高且無人為干擾動(dòng)物激素水平的子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立方法。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

性成熟未交配清潔級(jí)SD雌性大鼠65只，鼠齡60±5 d，體重200±25 g，來源于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK（遼）2013－0003】。標(biāo)準(zhǔn)光照周期（14 h光照、10 h黑夜）、室內(nèi)溫度（20±2℃）、濕度40%～60%、標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。無菌手術(shù)在大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行【SYXK（遼）2013－ 0006】。

1.2器械及藥品

普通眼科手術(shù)器械，電子游標(biāo)卡尺，5%水合氯醛，硫酸慶大霉素注射液，硫酸阿托品注射液，生理鹽水，醫(yī)用酒精，載玻片，復(fù)合碘消毒棉簽及碘伏棉球，無菌敷料包，強(qiáng)生4－0可吸收縫線及華利康4# 和7#絲線。

1.3子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立

每日晨8：00做陰道分泌物涂片檢查，65只大鼠中，動(dòng)情周期規(guī)律的有64只，約為3～5 d；動(dòng)情周期不規(guī)律的有1只。于動(dòng)情期分別進(jìn)行手術(shù)。手術(shù)室室溫25℃，電子消毒滅菌器行空氣消毒。

手術(shù)當(dāng)日，欲行手術(shù)的大鼠禁食水，術(shù)前稱重，5%水合氯醛按照7 mL/ kg的用量腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，于手術(shù)準(zhǔn)備區(qū)腹部用備皮刀備皮，仰臥位固定大鼠四肢于手術(shù)臺(tái)上，碘伏棉球消毒兩次，鋪無菌巾，于尿道口上1 cm沿腹正中線做2～3 cm縱切口，逐層入腹。探及左側(cè)子宮，上距卵巢約1 cm，下至子宮分叉處以上，結(jié)扎剪取約2～2. 5 cm子宮，沿系膜縱行剖開，自一角用無齒鑷鉗夾子宮內(nèi)膜，齒鑷鉗夾子宮漿膜層，“撕脫法”分離子宮內(nèi)膜并殘留少許肌層組織。將內(nèi)膜剪成約5× 5 mm的小段，臨時(shí)置于腹腔內(nèi)。腹膜移植：翻開一側(cè)腹膜，尋找遠(yuǎn)離切口且有血管分支走行處用柳葉刀輕輕劃毛腹膜，取小段的子宮內(nèi)膜，將內(nèi)膜面朝向腹膜，4－0可吸收線固定四角（不宜形成張力），同法處理另一側(cè)。皮下移植：銳性沿大鼠皮膚與肌層間隙分離出狹長(zhǎng)“隧道”，亦找血管分支走行處用柳葉刀輕輕劃毛肌層一側(cè)，將內(nèi)膜段的內(nèi)膜面朝向肌層展平，無需縫合，同法處理對(duì)側(cè)。腹腔內(nèi)留置0. 4 mL（1. 6萬(wàn)單位）慶大霉素后分兩層關(guān)腹。用碘伏將切口周圍血漬擦凈、切口包扎，單獨(dú)置于干凈飼養(yǎng)籠中，于嬰兒搶救床保溫直至蘇醒。

術(shù)后第一日查看有無排便，予食水，肌注慶大霉素0. 1 mL/ d連續(xù)3 d，若有嗑咬縫線導(dǎo)致皮膚縫合口裂開，可每日碘伏棉簽消毒切口，并適當(dāng)延長(zhǎng)抗生素用藥時(shí)間。

參照組患者最大年齡82歲,最小年齡64歲,平均年齡(75.6±0.3)歲;其中女性12例,男性18例。實(shí)驗(yàn)組患者最大年齡81歲,最小年齡65歲,平均年齡(74.6±0.3)歲;其中女性13例,男性17例。兩組患者在一般資料中未出現(xiàn)差異,P>0.05,不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可比。

建模成功的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：（1）建模成功肉眼觀察標(biāo)準(zhǔn)：見到原部位移植物形成透明、半透明囊腫或紫蘭色結(jié)節(jié)；（2）鏡下病理檢查診斷標(biāo)準(zhǔn)：移植物已生長(zhǎng)成一個(gè)或數(shù)個(gè)腔樣結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)面的上皮、固有膜及固有膜的基質(zhì)細(xì)胞、腺體樣結(jié)構(gòu)與在位子宮內(nèi)膜相似，腔內(nèi)可有分泌物和炎細(xì)胞存在，可見泡沫細(xì)胞反應(yīng)，陳舊性出血，內(nèi)膜上皮及上皮下可見少量含鐵血黃素顆粒狀沉積。腹膜移植有一處成模即算為成功，皮下移植亦如此。

1.4觀察指標(biāo)

建模后第4周再次開腹手術(shù)，觀察腹膜移植及皮下移植的成模情況；電子游標(biāo)卡尺測(cè)量子宮內(nèi)膜異位病灶的長(zhǎng)、寬和高，并計(jì)算其體積（V）=0. 52× 長(zhǎng)×寬×高［2－3］；比較腹膜及皮下的建模成功率和病灶體積大小有無差異。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)（1/5以上格子的期望頻數(shù)小于5，改用Fisher確切概率檢驗(yàn)），計(jì)量資料進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，滿足正態(tài)分布后使用方差分析，以α=0. 05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0. 05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠存活及成模情況

64只建模大鼠，有3只因麻醉導(dǎo)致呼吸道分泌物過多，手術(shù)當(dāng)日窒息死亡；1只術(shù)后第5天，因咬斷皮膚縫線，于麻醉縫合后死亡。存活60只大鼠，4周后再次剖腹探查。

組織學(xué)觀察可見：異位病灶與子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)基本一致，但間質(zhì)層偏薄，腺體少，囊泡外周可見少量肌層組織殘留（圖2B、C）。紫藍(lán)色結(jié)節(jié)（圖1C）經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為異位病灶，腔內(nèi)含中性粒細(xì)胞和泡沫細(xì)胞。可能與建模時(shí)刀劃出血有關(guān)。

將咬斷縫線再次麻醉縫合后死亡的大鼠解剖發(fā)現(xiàn)，皮下移植子宮內(nèi)膜已基本成活，腹膜移植子宮內(nèi)膜因縫合存在張力，未成活。此后的45只大鼠行建模手術(shù)時(shí)，移植到腹膜的子宮內(nèi)膜均采用無張力縫合。

腹膜移植成功31例，成功率51. 7%（31/60）；皮下移植成功53例，成功率88. 3%（53/60）；兩部位建模成功率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）（表1）。

圖1　子宮內(nèi)膜異位癥病灶Fig. 1 Endometriosis lesions

圖2　大鼠子宮及子宮內(nèi)膜異位癥病灶HE染色切片Note：A. Uterine section，×4；B. Endometriosis lesions section，×4；C. Endometriosis lesions section，×10；a. Endometrium；b. Myometrium；c. Serosa；d. Hyperplasia tissue.Fig. 2 Rat uterus and Endometriosis lesions HE staining

表1　建模大鼠腹膜移植與皮下移植成功率比較（%）Tab. 1 The comparison of success rate between peritoneal transplantation and subcutaneous transplantation in rats（%）

2.2腹膜及皮下異位病灶體積比較

建模后第四周再次開腹，測(cè)量異位病灶體積，腹膜移植病灶的中位體積為14. 70（2. 18，126. 15）mm3，皮下移植病灶的中位體積為18. 54（1. 04，249. 02）mm3，兩部位病灶體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0. 609）。

3　討論

子宮內(nèi)膜異位癥是由子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）在子宮體以外的部位生長(zhǎng)、蔓延形成，以卵巢最為多見。1921年sampsons首先提出異位種植學(xué)說，1984年Jone等［4－5］據(jù)此學(xué)說用動(dòng)情期SD大鼠通過自體子宮內(nèi)膜移植法建立內(nèi)異癥模型，亦有報(bào)道使用手術(shù)方法建立靈長(zhǎng)類子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型，但由于此類動(dòng)物費(fèi)用昂貴、飼養(yǎng)要求高，使其應(yīng)用受到限制。而大鼠自發(fā)性排卵、周期規(guī)律、費(fèi)用較低，且大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型與人類子宮內(nèi)膜異位癥在組織學(xué)特點(diǎn)、炎癥免疫等方面較相似，使其成為研究子宮內(nèi)膜異位癥治療新方法的較理想動(dòng)物模型［6］。

文獻(xiàn)報(bào)道的大鼠子宮內(nèi)膜異位癥建模成功率不盡相同，約60%～90%，Do AmaralI等［7］用自體移植法建立Wistar大鼠腹膜子宮內(nèi)膜異位模型，移植時(shí)子宮內(nèi)膜面朝向腹腔內(nèi)縫合，術(shù)后30 d（N1 = 15）成膜率83. 3%，術(shù)后60 d（N2 = 15）成模率71. 4%，兩組病灶大小、數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。子宮內(nèi)膜異位癥為雌激素依賴性疾病，張穎等［8］的研究術(shù)前術(shù)后均外源性給予雌激素，每日肌注雌二醇0. 1 mg/ kg，建模成功率約為90%。Pereira等［9］的研究顯示建模時(shí)使用雌激素，可使異位病灶的濕重和干重顯著增大。Ozer等［10］將Wistar大鼠帶有肌層組織的子宮內(nèi)膜縫合到血運(yùn)較豐富的腹膜上，觀察14 d，EMs造模成功率約為89. 6%（43/48），整個(gè)建模過程未使用激素類藥物。此次研究建模過程亦未使用雌激素，總體建模成功率為93. 3%。外源性雌激素的使用雖然可以簡(jiǎn)化大鼠建模過程，提高建模成功率，但動(dòng)物內(nèi)異癥模型的建立，部分是用于研發(fā)新藥的療效的觀察，給予外源性雌激素的建模并非正常生理狀態(tài)，對(duì)于內(nèi)異癥治療新方法的安全性評(píng)估是否會(huì)造成干擾，目前尚沒有相關(guān)報(bào)道。

卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥可能發(fā)病機(jī)制之一為卵泡排出后卵巢的創(chuàng)面會(huì)有利于逆流的子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞種植，基于這一理論，本次子宮內(nèi)膜異位模型的建立，首次采用“刀劃法”，即選取腹膜及肌層表面有血管分支走行處、用柳葉刀輕輕劃毛后再移植子宮內(nèi)膜，術(shù)中操作注意刀劃不宜過深，不能切斷血管。其總體建模成功率為93. 3%，在大鼠內(nèi)異癥建模已有報(bào)道的成功率中處于較高水平。

廣泛粘連導(dǎo)致腸梗阻和感染是建模大鼠死亡的主要原因，哈春芳等［11］實(shí)驗(yàn)中腸梗阻發(fā)生率為10. 81%，感染率為29. 72%。手術(shù)大鼠當(dāng)日晨需禁食水，腸道空虛不僅易于手術(shù)操作，還可減少腸梗阻的發(fā)生，能有效減少大鼠死亡。手術(shù)器械消毒、術(shù)中無菌操作嚴(yán)格，可以減少盆腔膿腫的發(fā)生，減少大鼠死亡。術(shù)后拭凈腹部切口周圍的血跡，可以減少大鼠嗑咬縫線，術(shù)后7 d內(nèi)一旦發(fā)現(xiàn)有咬線現(xiàn)象，應(yīng)每日消毒腹切口，并適當(dāng)延長(zhǎng)抗生素的使用，不建議再次麻醉縫合，以免大鼠不能耐受麻醉死亡。術(shù)時(shí)或術(shù)后蘇醒期若發(fā)現(xiàn)大鼠眼部分泌物增多，呼吸時(shí)聞及濕啰音，應(yīng)及時(shí)給予0. 1 mg硫酸阿托品肌肉注射，可有效減少腺體分泌，減少窒息死亡的發(fā)生；術(shù)后蘇醒期應(yīng)將大鼠置于恒溫保暖處，也可在籠底鋪加熱墊。

已有文獻(xiàn)報(bào)道中認(rèn)為腹膜移植及皮下移植建模成功率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［12－13］，但本研究中腹膜移植成功率明顯低于皮下移植，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因，可能與腹腔內(nèi)免疫監(jiān)視、免疫殺傷細(xì)胞對(duì)異位內(nèi)膜的清除作用較皮下強(qiáng)有關(guān)。且皮下移植無需縫合固定，能縮短手術(shù)時(shí)間，減少縫線引起的排異反應(yīng)，提高建模成功率。另皮下異位病灶位置表淺，便于觀察，可不必二次開腹，通過觸摸腹部便可判斷建模是否成功，能有效減少動(dòng)物死亡。在用藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的過程中，便于每日觀察病灶變化，判斷用藥效果。

綜上所述，使用“刀劃法”建立皮下子宮內(nèi)膜異位癥模型，比腹膜移植建模成功率高，且無需外源給予雌激素，便能達(dá)到與激素建模相當(dāng)?shù)某晒β?，是一種提高大鼠子宮內(nèi)膜異位癥建模成功率的新方法，能為探索子宮內(nèi)膜異位癥治療新方案提供理想的動(dòng)物模型。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Nnoaham KE，Hummelshoj L，Webster P，et al. Impact of endometriosis on quality of life and work productivity：a multicenter study across ten countries［J］. Fertil Steril，2011，96 （2）：366－373.

［2］ 宋淑芳，尹利榮，齊之迎.來曲唑治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型作用及機(jī)制的研究［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2011，20（1）：35 －38.

［3］ Zulfikaroglu E，Islimye M，Aydin M，et al. Efficacy of antitumor necrosis factor therapy on endometriosis in an experimentalrat model［J］. Arch Gynecol Obstet，2011，283（4）：799－804.

［4］ Harirchian P，Gashaw I，Lipskind ST，et al. Lesion kinetics in a nonhuman primate model of endometriosis［J］. Hum Reprod，2012，27（8）2341－2351.

［5］ Donnez O，Van Langendonckt A，Defrere S，et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon model mimicking human deep nodular lesions［J］. Fertil Steril，2013，99（3）：783－789.

［6］ Greaves E，Cousins FL，Murray A，et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium［J］. Am J Pathol，2014，184（7）：1930－1939.

［7］ Do AmaralI VF，Dal Lago EA，Kondo W，et al. Development of an experimental model of endometriosis in rats［J］. Rev Col Bras Cir，2009，36（3）：250－255.

［8］ 張穎，曹洪，張昌軍，等.改良大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立及微血管密度觀察［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，16（1）：56－58.

［9］ Pereira FE，Almeida PR，Dias BH，et al. Development of a subcutaneous endometriosis rat model［J］. Acta Cir Bras，2015，30（1）：6－12.

［10］ Ozer H，Boztosun A，Acmaz G，et al. The efficacy of bevacizumab，sorafenib，and retinoic acid on rat endometriosis model［J］. Reprod Sci，2013，20（1）：26－32.

［11］ 哈春芳，肖成明，張晟寧，等.開放法大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立與評(píng)價(jià)［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，49（1）：62－66.

［12］ 胡春萍，王志剛，季夏蕓，等.大鼠子宮異位癥模型建立方法的比較［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（10）：44－46.

［13］ 彭艷，何援利.大鼠子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型建立方法的比較［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（25）：2619－2620.

〔修回日期〕2015－11－12

A new method for improving the success rate of the establishment of endometriosis models in rats

LI Long-wei，WANG Yan-yun，CHEN Qi，WANG Ya-ping，HAN Lu
（The Maternity Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian Maternal and Child Health Hospital，Liaoning Dalian 116033，China）

【Abstract】Objective To provide ideal endometriosis animal models for research new treatment methods. Methods 64 Sexual mature without pregnant SD rats who has regular oestrous cycle were underwent operation that autologous endometrium were transplanted to peritoneum and subcutaneous with lancet gently cut tissue of where to transplant in the rut，and compared the model of peritoneum and subcutaneous after 4 weeks. Results The general success rate of autologous endometrium transplantation in rat estrus was 93. 3%，and the peritoneum transplantation success rate was 51. 7%，subcutaneous was 88. 3%，the difference of the two place transplantation has statistical significance. Compare the two parts of volume of endometriosis，there was no statistically significant difference. Conclusion Using the lancet to establish the endometriosis model has a high success rate，and subcutaneous model is better than peritoneum.

【Key words】Endometriosis；Model，animal；Estrus；Rodentia

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）03-0081-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 016

［作者簡(jiǎn)介］李龍衛(wèi)（1987－），女，住院醫(yī)師，碩士，婦產(chǎn)科，E-mail：longwei198787@163. com。

［通訊作者］韓璐，女，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：13940801858@163. com。