紀 磊，岑江杰，林師道，胡成云，方 華，徐 劍，陳 杰（浙江省化工研究院有限公司，杭州 310023）

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伊維菌素原藥對大鼠的亞急性吸入毒性研究

紀 磊，岑江杰，林師道，胡成云，方 華，徐 劍，陳 杰
（浙江省化工研究院有限公司，杭州 310023）

【摘要】目的 研究伊維菌素原藥對大鼠亞急性吸入毒性，求出最大無作用劑量。方法 采用SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠，共72只，隨機分成6組，每組12只，雌雄各半。設190、380、750 mg/ m3等3個劑量組和1個溶劑對照組（0. 03%吐溫－80溶液），另設1個空白對照和1個附加組（750 mg/ m3）。采用動式（口鼻式）吸入染毒，每天染毒1次，持續(xù)4 h，每周染毒5 d，直至28 d，附加組動物停止染毒后繼續(xù)觀察14 d。試驗結束后，分別對動物作血液常規(guī)、生化、體重及臟器系數(shù)等測定，并進行組織病理學檢查。結果 750 mg/ m3劑量組雌雄大鼠在染毒后期出現(xiàn)被毛蓬松、呆滯、流涎、震顫等中毒反應。750 mg/ m3劑量組雌鼠食物利用率下降，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平升高（P＜0. 01），肝臟器系數(shù)（臟體比）升高（P＜0. 05），且病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠肝細胞混濁腫脹現(xiàn)象；750 mg/ m3劑量組雄鼠染毒第4周的體重下降，血清尿素氮（BUN）和ALT水平升高（P＜0. 01），總膽固醇（CHOL）水平下降（P＜0. 05）。結論 伊維菌素原藥對大鼠亞急性吸入毒性試驗的最大無作用劑量雌、雄性均為380 mg/ m3（4 h/ d）。

【關鍵詞】伊維菌素原藥；亞急性吸入毒性；最大無作用劑量

伊維菌素（ivermectin，IVM）是由阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的半合成大環(huán)內(nèi)酯類多組分抗生素，自1981年投入市場作為獸用驅(qū)蟲藥后，IVM因其高效及安全的殺蟲效果，已被廣泛應用于殺滅寄生在家畜及水產(chǎn)動物等體內(nèi)的線蟲和節(jié)肢動物。但即便如此，隨著伊維菌素市場需求量的不斷增大，其對健康的影響仍應該受到重視。目前伊維菌素的毒性文獻報道較少，為了解較長時間暴露伊維菌素可能引起的毒性效應，我們根據(jù)國家標準GB15670－1995《農(nóng)藥登記毒理學試驗方法》并參考經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）化學品測試方法［1－2］對伊維菌素的大鼠亞急性吸入毒性進行了研究。

1　材料和方法

1.1受試物

伊維菌素原藥，本白色粉未，無刺激性氣味，難溶于水，含量為90%，由浙江某農(nóng)藥公司提供。

1.2儀器

HOPE-8052型吸入染毒裝置、美普達UV-6100紫外可見分光光度計、日立7020型全自動血生化分析儀、MEK-7222K全自動血細胞分析儀、優(yōu)利特－ 200自動尿液分析儀、Thermo Shandon Excelsior脫水機、Thermo Shandon Histocentre 2石蠟包埋機、Leica RM2235輪轉(zhuǎn)式切片機。

1.3動物及環(huán)境

試驗采用72只SPF級SD大鼠，雌雄各半，雌鼠體重184～203 g，雄鼠體重198～211 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK（滬）2008－ 0016】提供。本研究在本機構動物實驗設施中進行【SYXK（浙）2009－0125】，動物房內(nèi)通風10～12 次/ h，人工照明，12 h/12 h明暗交替，室溫20°C～26°C，相對濕度40%～70%，動物單獨編號，同性別2只一籠，飼養(yǎng)于不銹鋼籠具內(nèi)，動物自由攝食，飲用滅菌水，飼料為全價營養(yǎng)輻照飼料。本研究編號為APS2013120258A，經(jīng)過實驗動物管理小組審核批準后實施，按實驗動物使用的3R原則給予實驗動物人道關懷。

1.4劑量設計

預先進行大鼠急性吸入毒性試驗和3周反復吸入毒性試驗，得出伊維菌素原藥急性吸入LD50（吸入4 h）為3690（2710－5010）mg/ m3。3周反復吸入試驗顯示：在380 mg/ m3劑量條件下動物無明顯中毒癥狀及體重和進食量無明顯差異，在750 mg/ m3劑量條件下，第5天起動物開始出現(xiàn)流涎、被毛潮濕等中毒癥狀，在染毒結束回籠2 h后逐漸恢復，次日染毒前癥狀基本消失。3周染毒期間動物無死亡。因此正式試驗中，將動物按體重隨機分成190、380、750 mg/ m3等3個劑量組，1個溶劑對照組（0. 03%吐溫－80溶液）、1個空白對照組和1個附加組（750 mg/ m3），每組12只，雌雄各半。

1.5供試品配制

供試品先加入1%吐溫－80進行乳化，用蒸餾水配成不同濃度乳化液，作為各劑量組和附加組的試驗用液?？瞻讓φ战M不使用任何溶劑和供試品，吸入染毒直接通空氣。溶劑對照組采用0. 03%吐溫－80蒸餾水溶液，其它條件同試驗組。

1.6染毒方法

采用HOPE-8052型動式吸入（口鼻式）染毒裝置，染毒裝置柜體容積為0. 06 m3。大鼠用固定器固定后插于染毒柜上，僅暴露口鼻。設定染毒裝置參數(shù)：藥物流速1. 3 mL/ min、進氣流速2. 2 m3/ h、染毒時間4 h。用磁力攪拌器低速攪拌受試液，啟動染毒裝置，發(fā)生氣溶膠。染毒期間染毒柜內(nèi)保持溫度在20℃～26℃、氧含量不低于19%，染毒期間動物禁食、禁水，染毒結束，取出動物回籠、自由進食飲水。每天連續(xù)經(jīng)呼吸道吸入染毒4 h，每周染毒5 d，直至28 d，附加組動物在染毒結束后繼續(xù)觀察2周。

1.7濃度測定

在染毒柜內(nèi)動物呼吸帶，用大氣采樣機串聯(lián)氣泡吸收管（以10 mL甲醇為吸收液）采集5 L（流量1 L/ min、采集時間5 min）染毒氣溶膠，應用紫外分光光度法（以受試物為標樣，以245 nm為測定波長），于第1、2、3、4、5、15、22、28天，每天3次，采樣測定動物呼吸道染毒濃度，平均值為實測濃度。

1.8觀察指標

1.8.1一般指標：試驗期間每日觀察大鼠的活動和中毒癥狀，并進行周進食量和周體重變化的記錄，并測定食物利用率。

1.8.2血生化和血常規(guī)測定：于試驗結束時，各組大鼠經(jīng)眼眶靜脈采血，進行血液生化和血常規(guī)測定。血液生化指標包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽固醇（CHOL）、膽堿酯酶（CHE）、血糖（GLU）等。血常規(guī)指標包括白細胞計數(shù)（WBC）及其分類、紅細胞計數(shù)（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細胞分布寬度（RDW）、血小板計數(shù)（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板分布寬度（PDW）、血小板壓積（PCT）等。

1.8.3尿常規(guī)測定：試驗結束前1 d留取6 h尿液進行尿常規(guī)測定，指標包括尿pH值、亞硝酸鹽（NIT）、蛋白質(zhì)（PRO）、糖（GLU）、維生素C（VC）、隱血（BLD）、比重（SG）、膽紅素（BIL）、尿膽原（URO）、酮體（KET）、白細胞計數(shù)（WBC）等。

1.8.4臟器系數(shù)及病理檢查：試驗結束動物進行大體解剖，檢查各臟器肉眼可見病變，稱取腦、心、肺、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸和卵巢等臟器濕重，計算臟器系數(shù)。對溶劑對照組、空白對照組、高劑量組及附加組動物主要臟器以及大體解剖時發(fā)現(xiàn)的異常組織取樣固定于15%中性甲醛溶液，作組織病理學檢查。

1.9統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1受試物染毒濃度實測結果

在染毒期間實測動物呼吸帶受試物濃度24次，測得190、380、750 mg / m3和附加組的受試物平均濃度分別為184、380、739、741 mg/ m3。

2.2一般狀況、進食量及體重檢查

750mg/ m3劑量組雄鼠體重與溶劑對照組相比下降，差異與有極顯著性意義（P＜0. 01），其余各組動物體重與溶劑對照組相比無明顯差異（P＞0. 05）。各組進食量與溶劑對照組相比無明顯差異（P＞0. 05），750 mg/ m3劑量組雌鼠的食物利用率與溶劑對照組相比下降，差異有極顯著性意義（P ＜0. 01）（表1）。750 mg/ m3劑量組和附加組在染毒的第15～26天相繼觀察到個別或部分動物出現(xiàn)被毛蓬松、流涎、被毛潮濕、俯臥及震顫癥狀。上述癥狀在動物染毒結束回籠2 h后開始緩解，次日染毒前均恢復正常。其他劑量組和對照組動物均未觀察到中毒癥狀。附加組動物中毒癥狀在2周觀察恢復期開始后2～3 d消失，亦未見死亡。

2.3血液生化測定

血液生化測定顯示染毒結束750 mg/ m3劑量組雌雄大鼠的ALT水平顯著高于溶劑對照組（P＜0. 01）；雄鼠的BUN水平顯著高于溶劑對照組（P＜0. 01）；雄鼠的CHOL水平低于溶劑對照組（P＜0. 05），其他血液生化指標未見異常改變（表2）。

表1　伊維菌素原藥對大鼠體重變化和食物利用率的影響Tab. 1 Effects of Ivermectin TC on body weight and feed efficiency in the rat

表2　伊維菌素原藥對大鼠血液生化指標的影響Tab. 2 Effects of Ivermectin TC on blood biochemical index in the rat

表3　伊維菌素原藥對大鼠臟器系數(shù)的影響Tab. 3 Effects of Ivermectin TC on organ indexes in the rat

2.4血常規(guī)測定

血常規(guī)測定顯示染毒結束190 mg/ m3劑量組雄鼠RBC和HGB水平高于溶劑對照組（P＜0. 05），但與空白對照組相比差異無顯著性，且在本實驗室檢測值正常范圍內(nèi)，故無臨床意義；雌鼠的血液學指標均未見異常改變。

2.5尿常規(guī)測定

尿常規(guī)檢測結果顯示各劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0. 05）。

2.6臟器系數(shù)和病理學檢查

染毒結束時，動物大體解剖顯示，190 mg/ m3劑量組1例雄鼠右腎缺如，左腎大，其余均未見腫瘤及其它肉眼可見的病變。臟器系數(shù)結果表明，750 mg/ m3劑量組雌鼠肝臟器系數(shù)高于溶劑對照組雌鼠，有顯著性差異（P＜0. 05）（表3）。病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)，750 mg/ m3劑量組部分雌鼠肝臟出現(xiàn)肝細胞混濁腫脹現(xiàn)象（圖1）。其它動物受檢臟器均未見有意義的組織病理學改變。

圖1　伊維菌素引起高劑量組雌性大鼠肝臟混濁腫脹（HE×10）Note：A. In the solvent control group，there was no abnormal liver in the female rat；B. In the high dose group of 750mg/ m3，Hepatic cell cloudy swelling was observed in the female rat.Fig. 1 Ivermectin caused by high dose group of female rat liver cloudy swelling（HE×10）

3　討論

伊維菌素的作用機制在于：藥物與蟲體細胞上的特異性高、親和力強的位點結合，影響蟲體細胞膜中的谷氨酸鈉離子通道對氯離子的通透性，進而引起抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）的釋放增加，GABA作用于突觸前的神經(jīng)末梢，減少興奮性遞質(zhì)的釋放，使突觸后膜產(chǎn)生興奮性突觸后電位減少，突觸后神經(jīng)元因膜電位的去極化程度達不到閾值而不能進入興奮狀態(tài)，從而引起抑制而使蟲體麻痹、死亡［3－7］。此次實驗研究我們對大鼠進行反復吸入伊維菌素原藥28 d后，發(fā)現(xiàn)：在750 mg/ m3劑量組，雌雄大鼠在染毒后期出現(xiàn)被毛蓬松、呆滯、流涎、震顫等中毒反應，雌鼠食物利用率下降、血液ALT水平與肝臟體比升高，且病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠肝細胞混濁腫脹現(xiàn)象；雄鼠血液ALT和BUN水平升高、第4周體重和CHOL水平下降。在750 mg/ m3以下劑量組動物均未發(fā)現(xiàn)有意義的改變。附加組（750 mg/ m3）動物在停止染毒后14 d觀察期內(nèi)體重、食物利用率以及血生化水平等指標均恢復正常。在本試驗條件下，伊維菌素原藥對大鼠亞急性吸入毒性試驗的最大無作用劑量雌、雄性均為380 mg/ m3（4 h/ d）。在反復吸入750 mg/ m3伊維菌素后，雌雄大鼠血液ALT水平上升，雄鼠BUN水平上升，雌鼠肝臟體比升高，且病理檢查肝臟有肝細胞混濁腫脹現(xiàn)象，因此初步判斷肝臟可能是伊維菌素作用靶器官。本試驗結果為安全評價伊維菌素原藥的亞急性吸入毒性提供了有價值的毒理學資料，并為慢性毒性試驗劑量設計提供良好參考。

有文獻報道［6］，伊維菌素的藥動學顯示，給藥途徑（經(jīng)口或皮下注射）、動物種類對趨殺體內(nèi)外寄生蟲的療效沒有影響，均吸收迅速，分布廣泛，對動物經(jīng)口服用（犬、豬）或皮下注射（牛、羊），生物利用度均可達95%。伊維菌素原藥對大鼠急性經(jīng)口LD50（mg/ kg）：雄11. 6，雌24. 6－41. 6［7］，按GB15670－1995［1］判定，伊維菌素屬高毒。而我們測得伊維菌素原藥對大鼠急性吸入LC50（吸入4 h）為3690（2710－5010）mg/ m3，屬低毒。還有文獻報道，伊維菌素與P-糖蛋白抑制劑聯(lián)合使用時，會對雄鼠生殖系統(tǒng)造成影響［8］；對雄性大白鼠經(jīng)口灌胃給予伊維菌素達到一定劑量時，可引起大白鼠睪丸及附睪臟器系數(shù)下降［9］；對雄性鯽空腹口灌給予伊維菌素時，雄性鯽生殖腺指數(shù)（GSI）下降［10］，而本次研究未觀察到雄性大鼠睪丸臟器系數(shù)下降，這可能與給藥途徑不同有關。伊維菌素的經(jīng)口與吸入毒性差異很大，說明暴露途徑非常重要，在伊維菌素使用上要著重避免經(jīng)消化道接觸，獸醫(yī)或動物醫(yī)院在使用伊維菌素時，要嚴格保管，防止丟失。

參考文獻：

［1］ 國家技術監(jiān)督局. GB15670－1995.農(nóng)藥登記毒理學試驗方法［S］.

［2］ OECD. OECD Guideline for Testing of Chemicals，412 Subacute Inhalation Toxicity：28-Day Study［S］. Paris：OECD，2009.

［3］ David W F. Analytical profiles of drug substances，Ivermectin［J］.1988，17：155.

［4］ 吳中興，錢益新.伊維菌素的藥效、藥理和臨床研究［J］.熱帶病與寄生蟲學，2003，1（3）：184－187.

［5］ 黃清臻.新型殺蟲殺蛾劑－伊維菌素［J］.中華衛(wèi)生殺蟲藥械，2003，9（3）：75－76.

［6］ 徐楷，王巧玲.獸用伊維菌素研究進展［J］.國外畜牧學－豬與禽，2011，31（1）：85－86.

［7］ 劉長令.世界農(nóng)藥大全－殺蟲劑卷［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2012：71－74.

［8］ Abeer FE，Ibrahim ME. Effect of ivermectin on male fertility and its interaction with P-glycoprotein inhibitor（verapamil）in rats. Environmental Toxicology and Pharmacolgy，2008，26：206－211.

［9］ 姜曉文，馮國鋒，徐明星.伊維菌素對雄性大白鼠生育功能的影響［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（6）：174－175.

［10］ 王荻，李紹戊，耿龍武，等.伊維菌素對雄性鯽的生殖毒性評價［J］.應用生態(tài)學報，2015，26（10）：3174－3180.

〔修回日期〕2016－01－19

Study on the subacute inhalation toxicity of ivermectin TC in rats

JI Lei，CEN Jiang-jie，LIN Shi-dao，HU Cheng-yun，F(xiàn)ANG Hua，XU Jian，CHEN Jie
（Zhejiang Research Institute of Chemical Industry，Hangzhou 310023，China）

【Abstract】Objective To study the subacute inhalation toxicity of Ivermectin TC，and obtain its non-observed adverse effect level（NOAEL）. Methods It was performed on the doses of Ivermectin TC 190，380，750 mg/ m3，the solvent control group（0. 03%Tween-80 solution），the control group and additional group（there were 6 female and 6 male Sprague-Dawley rats for each group）. The animals inhaled with nose-only exposure for 4 weeks（4 h/ d，5 d/ week）. The additional group should be observed another 14 days after exposing. At the end of experiment，the rats were killed，the routine and biochemical detection，the body weight and organ to body weight ratios were all measured. Results In the high exposure group，clinical signs of rats included hair fluffy，dull，salivation，tremors were recorded at the exposure period；in female rats，feed efficiency was decreased，ALT and liver to body weight ratio were increased；in male rats，BUN and ALT were increased，CHOL and body weight for the 4th week were decreased. Histopathological examinations revealed that swelling in the liver cell was seen in some female rats at high exposure group. Conclusion The results suggested that the NOAEL of Ivermectin TC in SD rats was 380 mg/ m3（4 h/ d for 28 days）.

【Key words】Ivermectin TC；Subacute inhalation toxicity；NOAEL

【中圖分類號】R114 R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0070-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 014

［作者簡介］紀磊，男，本科，助理研究員，從事農(nóng)藥及化學品安全性評價工作。