劉海鵬，鄭克彬，單小松（河北大學(xué)附屬醫(yī)院，神經(jīng)外科，河北保定071000）

?

靈芝酸A對人膠質(zhì)瘤細胞U251細胞增殖、凋亡和侵襲的影響

劉海鵬，鄭克彬，單小松
（河北大學(xué)附屬醫(yī)院，神經(jīng)外科，河北保定071000）

【摘要】目的 探討靈芝酸A對人膠質(zhì)瘤細胞U251細胞凋亡、侵襲及KDR表達的影響。方法 制備靈芝酸A，以人膠質(zhì)瘤細胞細胞U251細胞為研究對象，根據(jù)細胞培養(yǎng)液所含靈芝酸A的不同濃度，將實驗分為空白對照組（等量細PBS）、靈芝酸A低濃度組（0. 1 mmol/ L）和高濃度組（0. 5 mmol/ L）。用RT-PCR和Western blot法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測KDR基因的表達，CCK-8法測定細胞體外增殖能力，流式細胞技術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）檢測各組細胞周期和凋亡情況，TUNEL染色檢測各組細胞的的凋亡，細胞侵襲小室法檢測各組細胞的體外侵襲力。結(jié)果 RT-PCR和Western blot顯示，靈芝酸A高濃度組和低濃度組較空白對照組的KDR mRNA和蛋白表達都明顯下降；靈芝酸A高濃度組和低濃度組細胞的生長速度明顯減慢，降低G1期細胞比例，S期和G2/ M期比例增高；與空白對照組相比，高濃度組和低濃度組細胞的凋亡率明顯升高（P＜0. 01），增殖、侵襲能力顯著下降（P＜0. 05）；高濃度組和低濃度組細胞相比促進凋亡和抑制KDR表達的作用更明顯（P＜0. 05）。結(jié)論 靈芝酸A可誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細胞U251細胞凋亡，抑制其增殖和侵襲能力，并能抑制KdrDR mRNA和蛋白的表達，提示這可能是其抗腫瘤的作用機制之一。

【關(guān)鍵詞】靈芝酸A；膠質(zhì)瘤細胞；血管內(nèi)皮生長因子受體；細胞周期；凋亡

靈芝又稱仙草，屬于擔(dān)子菌綱多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬，有提高機體免疫力、降壓調(diào)脂及抗腫瘤等多種藥用價值，目前已引起醫(yī)療界的廣泛關(guān)注，尤其是其在抗腫瘤方面［1］。研究發(fā)現(xiàn)，其抗腫瘤的主要成分是從靈芝孢子粉中提取的靈芝酸A［2－3］。神經(jīng)膠質(zhì)瘤又稱膠質(zhì)細胞瘤，是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的類型，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半［4］。目前關(guān)于靈芝酸A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究頗多，但主要局限于抗腫瘤機制方面，在藥理作用及療效方面還有待進一步的研究［5－6］。血管內(nèi)皮生長因子受體II激酶功能區(qū)受體（vascular endothelial growth factorⅡ，VEGFR2/ kinase domain receptor，KDR）在許多類型腫瘤中高表達，其阻滯劑可調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞瘤等多種惡性腫瘤生長［7－8］。本文主要研究靈芝酸A對人膠質(zhì)瘤U251細胞的生物學(xué)影響及KDR表達的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1材料

實驗于2013年8月－2015年8月在河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗室完成，人膠質(zhì)瘤細胞系（U251）來源北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理教研室提供，并由本實驗室凍存；DMEM、磷酸鹽緩沖液（phosphatic buffered saline，PBS）、胎牛血清均購自美國Gibco公司；TRIzol購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海Best- Bio貝博公司；熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司、DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司；Western blot及苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、IP細胞裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、BCA蛋白濃度測試試劑盒（增強型）、20× TBS緩沖液等均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜購自美國Millipore公司；碘化丙錠PI和RNase酶購自Sigma公司；流式細胞儀購自美國BD公司；凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；靈芝酸A購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；KDR和GAPDH基因的引物由上海吉瑪制藥公司合成并通過測序驗證；兔抗人KDR單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和分組

將培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U/ mL左氧氟沙星的DMEM培養(yǎng)基中的人膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞，置于37℃5%CO2密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)、傳代。把用50 mmol/ L甲醇溶解好的靈芝酸A放于4℃的冰箱中保存。依據(jù)靈芝酸A的濃度不同分為低濃度組（0. 1 mmol/ L）、高濃度組（0. 5 mmol/ L）和對照組（1%甲醇0. 2 mL）。將3組細胞放于37℃的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2RT-PCR檢測KDR mRNA表達

用TRIzol試劑盒提取培養(yǎng)48 h后U251細胞的總RNA量，并進行反轉(zhuǎn)錄。Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物，KDR上游引物：5 '-CTGGCATGGTCTFCTGTGAAGCA -3’，下游引物：5’-AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3’，擴增產(chǎn)物795 bp；內(nèi)參照GAPDH上游引物：5’-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3’，下游引物：5’TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3’，擴增產(chǎn)物為509 bp。PCR反應(yīng)條件為94℃變性2 min、62℃退火1 min、72℃延伸1 min，循環(huán)35次，再于72℃延伸8 min。經(jīng)1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像儀觀察結(jié)果，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 7. 0軟件分析條帶灰度值，KDR/ GAPDH比值代表KDR mRNA的相對表達量。

1.2.3Westernblotting檢測KDR蛋白表達

提取培養(yǎng)48 h后各組的總蛋白并測定蛋白濃度。將50 μg總蛋白進行上樣、8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜并用10%脫脂奶粉封閉2 h，加入KDR、GAPDH（1∶800稀釋），于搖床上4℃孵育過夜。用三乙醇胺緩沖鹽水溶液洗滌3次，每次10 min，洗膜后加入二抗（1∶5000）。最后暗室曝光，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白條帶，獲取圖像并進行條帶灰度值分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.2.4CCK8法檢測U251細胞的增殖

將U251細胞按4000個/孔的細胞密度接種于96孔板上，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔，另設(shè)空白孔作為對照。每孔加入CCK-8 20 μL，培養(yǎng)箱孵育4 h后，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度（D）值，取5個復(fù)孔的平均數(shù)，繪制生長曲線。

1.2.5Transwell小室侵襲實驗

將Matrigel按50 μg/孔的濃度置于聚碳酸酯微孔濾膜上進行聚合，每孔下室中加入10%的胎牛血清做條件培養(yǎng)液，上室加入U251細胞懸液100 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，進行固定、染色并光鏡下計數(shù)膜下表面的細胞。每張微孔膜計數(shù)5個隨機視野的穿膜細胞數(shù)，計算平均數(shù)。每組設(shè)置3個小室，重復(fù)實驗3次。細胞侵襲率（%）=穿膜細胞數(shù)/上室中接種的細胞總數(shù)×100%

1.2.6細胞周期檢測

將細胞進行胰酶消化、PBS沖洗、70%乙醇固定，4℃過夜。用PBS沖洗，將細胞混合成1. 0× 105/ mL的細胞懸液，并以細胞懸液∶PI =1∶1加入適量PI液，4℃下避光孵育30 min，300目篩網(wǎng)過濾；流式細胞儀分析DNA含量，軟件分析G1、S、G2/ M各期的細胞數(shù)及所占比例。

1.2.7流式細胞儀檢測細胞凋亡

轉(zhuǎn)染72 h后，將細胞用不含EDTA的胰酶消化，消化完全后移入Ep管，4℃、2 000 r/ min，離心5 min，棄上清。PBS洗滌2次，加入500 μL buffer，5 μL Annexi n V -FITC，混勻；加5 μL PI混勻后室溫、避光反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測（激發(fā)波長Ex =488 nm，發(fā)射波長Em =530 nm）。

1.2.8TUNEL染色

細胞分組后72 h，行U251細胞爬片并棄培養(yǎng)液，自然晾干；4%多聚甲醛溶液固定，在室溫下用新鮮配制的3%H202進行處理，0. 1%TritonX-100（溶于0. 1%枸櫞酸鈉溶液）打孔，行顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片及觀察。每張切片觀察3個視野，每個視野連續(xù)計數(shù)300個細胞，凋亡細胞百分比即為凋亡指數(shù)（m）。AI（%）=凋亡細胞彩總細胞數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16. 0統(tǒng)計軟件進行分析，細胞凋亡計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），結(jié)果以±s表示，P＜0. 05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1靈芝酸A降低KDR mRNA的表達水平

RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)相關(guān)干預(yù)后U251細胞KDR mRNA水平高濃度組＜低濃度組＜空白對照組，且任意兩組間的比較均滿足上述關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）。由此說明低濃度和高濃度的靈芝酸A均能抑制KDR mRNA的表達，且高濃度的抑制效果更明顯（圖1）。

圖1　各組KDR mRNA的表達水平Fig. 1 KDR mRNA expression level of each group

2.2靈芝酸A降低KDR蛋白的表達水平

表達量與空白對照組相比明顯降低，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）；而低濃度組與空白對照組間相比KDR蛋白的表達量亦明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）。說明低濃度和高濃度的靈芝酸A均能抑制KDR蛋白的表達，且隨濃度的升高抑制效果更明顯（圖2）。

圖2　各組KDR蛋白的表達水平Fig. 2 KDR expression levels of each group

2.3CCK-8法檢測U251細胞增殖情況

CCK-8法檢測結(jié)果表明，3組在490 nm處的A值在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120 h時的大小依次是空白對照組＞低濃度組＞高濃度組，且任意兩組間比較均成立，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）。繪制的生長曲線示，高濃度組較空白對照組和低濃度組曲線明顯降低（表1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0. 05），低濃度組較空白對照組曲線亦降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）。表明靈芝酸A抑制U251細胞增殖，且隨濃度升高抑制作用更明顯。

表1　三組細胞各時間點細胞活力的比較490 nm（±s，n =5）Tab. 1 Comparison of cell viability between three groups of cells at different time points 490 nm（±s，n =5）

表1　三組細胞各時間點細胞活力的比較490 nm（±s，n =5）Tab. 1 Comparison of cell viability between three groups of cells at different time points 490 nm（±s，n =5）

注，Note：P＜0. 05

組別　24 h　48 h　72 h　96 h　120 h空白對照組　0. 41±0. 04　0. 63±0. 02　1. 44±0. 07　1. 86±0. 16　2. 92±0. 27低濃度組　0. 36±0. 02　0. 45±0. 05　1. 08±0. 13　1. 43±0. 12　2. 14±0. 15高濃度組　0. 24±0. 03　0. 31±0. 04　0. 62±0. 08　0. 97±0. 14　1. 38±0. 12

2.4靈芝酸A降低細胞體外侵襲力降低

3組穿過濾過膜的細胞數(shù)依次為：空白對照組＞低濃度組＞高濃度組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0. 01）。實驗結(jié)果表明靈芝酸A可以抑制U251細胞的體外侵襲力，且隨濃度的升高抑制作用增強。

2.5流式細胞術(shù)檢測細胞周期

由圖3及表2可知，與空白對照組相比，低濃度組和高濃度組G1期細胞比例均明顯降低（P＜0. 05），且高濃度組較低濃度組明顯（P＜0. 05）；而S、G2/ M期細胞比例則明顯升高（P＜0. 05）。

圖3　不同組G1、S、G2期的比較Fig. 3 G1，S，G2 phase comparison of different group

表2　各組細胞周期分布及凋亡率（%）Tab. 2 Cell cycle distribution and apoptosis rate（%）

2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

流式細胞儀檢測的DNA直方圖顯示：3組細胞凋亡率依次為高濃度組＞低濃度組＞對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05），表明靈芝酸A可以明顯促進U251細胞的凋亡，且隨濃度的增加而增強（圖4）。

2.7TUNEL染色觀察細胞凋亡

TUNEL染色觀察細胞凋亡結(jié)果顯示，3組中均出現(xiàn)細胞核被染成棕黃色的U251凋亡細胞，且3組細胞凋亡數(shù)依次為高濃度組＞低濃度組＞對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05），表明靈芝酸A可以明顯促進U251細胞的凋亡，且隨濃度的增加而增強（圖5）。

圖4　流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡Fig. 4 Cell apoptosis was detected by flow cytometry of each group

圖5　TUNEL染色觀察各組細胞凋亡Fig. 5 TUNEL staining of each group

3　討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的類型，迄今為止病因尚未闡明。雖然臨床上有手術(shù)、藥物及放化療等各種治療手段，但其病死率、復(fù)發(fā)率仍居高不下，尋求新的、有效的治療手段已成為了當(dāng)務(wù)之急［9－10］。

自上世紀(jì)80年代以來，靈芝治療腫瘤的確切機制已引起了醫(yī)務(wù)工作者的廣泛興趣。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝酸能激活可直接破壞腫瘤細胞核形成的蛋白酶，且抑瘤效果與其含量有明顯依賴性［11－12］。與本項研究結(jié)果相一致。本實驗研究表明靈芝酸A高濃度組和低濃度組較空白對照組的KDR mRNA和蛋白表達均明顯下降，證明靈芝酸A在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖力和侵襲力，促進細胞凋亡方面起到關(guān)鍵作用，提示調(diào)控KDR基因可能直接或間接地參與人膠質(zhì)瘤U251細胞周期的調(diào)控和凋亡，其基因的表達水平改變與腫瘤細胞侵襲力關(guān)系密切［13－14］。可能是其抑瘤作用的潛在機制之一。

人體是一個有機的整體，體外實驗不可能做到完全模擬人體生理情況，因此靈芝酸A對人膠質(zhì)瘤的療效尚需臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)進行綜合分析。目前，從分子機制探討靈芝酸A的抗腫瘤作用尚處于探索階段，對于惡性腫瘤的治療效果也尚處于觀察階段，需要我們繼續(xù)進行深入的研究以期早日攻克人膠質(zhì)瘤這一疾病。

參考文獻：

［1］ Reis FS，Lima RT，Morales P，et al. Methanolic extract of ganoderma lucidum induces autophagy of AGS human gastric tumor cells［J］. Molecules，2015，20（10）：17872－17882.

［2］ Yao X，Li G，Xu H，et al. Inhibition of the JAK-STAT3 signaling pathway by ganoderic acid A enhances chemosensitivityof HepG2 cells to cisplatin［J］. Planta Med，2012，78（16）：1740－1748.

［3］ Yajima Y，Miyazaki M，Okita N，et al. Production of Ginkgo leaf-shaped basidiocarps of the Lingzhi or Reishi Medicinal mushroom Ganoderma lucidum（higher Basidiomycetes），containing high levels of α-and β-D-glucan and ganoderic acid A ［J］. Int J Med Mushrooms，2013，15（2）：175－182

［4］ Srinivasan K，Thomas B. Teaching neuroimages：optic nerve glioma with perineural arachnoid gliomatosis in a patient with neurofibromatosis-1［J］. Neurology，2015，84（13）：e97.

［5］ Ameri A. Ganoderic Acid in the treatment of prostate cancer［J］. Jundishapur J Nat Pharm Prod，2012，7（3）：85－86.

［6］ Liu RM，Li YB，Zhong JJ. Cytotoxic and pro-apoptotic effects of novel ganoderic acid derivatives on human cervical cancer cells in vitro［J］. Eur J Pharmacol，2012，681（1－3）：23－33.

［7］ Song J，Song Y，Guo W，et al. Regulatory roles of KDR antisense oligonucleotide on the proliferation of human prostate cancer cell line PC-3［J］. Journal of Buon，2014，19（3）：770－ 774.

［8］ 張家文，馮曉源，姚振威，等. CT灌注成像與大鼠C6膠質(zhì)瘤CD105表達的相關(guān)性［J］.中國實驗動物學(xué)報，2013，21（03）：27－30，69，后插5頁.

［9］ 左龍，趙越，李懷業(yè)，等.磁共振示蹤法定量測量大鼠C6膠質(zhì)瘤模型細胞外間隙擴散參數(shù)［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（12）：1－7.

［10］ 王曉武，李康樗，丁桂榮，等. SD大鼠與Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型的建立及比較［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20 （05）8－11.

［11］ 黃書銘，楊新林，王幫武，等.靈芝醇溶酸性組分的抗腫瘤作用［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16（2）：146－148.

［12］ 唐文.靈芝酸T提高多藥耐藥性腫瘤細胞對阿霉素敏感性的初步研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（8）：1052 －1055.

［13］ 呂賢榮，丁蘇明，李國濤，等.體外MTT法對靈芝酸抗人乳腺癌細胞株MCF-7作用的評估［J］.醫(yī)學(xué)信息，2014，27（11）：92－92.

［14］ 邵建立，李志忠，焦根龍，等.靈芝酸A對人骨肉瘤細胞增殖、凋亡和遷移的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，35 （5）：619－624.

〔修回日期〕2016－01－20

Effect of Ganoderma acid A to human glioma cells U251 cells on proliferation，apoptosis and invasion

LIU Hai-peng，SHAN Xiao-song，ZHENG Ke-bin
（Affiliated Hospital of Hebei University，neurosurgery department，Hebei Baoding 071000，China）

【Abstract】Objective To investigate the effect of ganoderic acid A（GA-A）on apoptosis，invasion and KDR expression of human U251 cells. Methods Ganoderic acid A（GA-A）was prepared，human U251 cells were treated with 0. 1，and 0. 5 mmol/ L GA-A，and the experiment was divided into blank control，low concentration and high concentration group. The expressions of KDR mRNA and KDR protein was assayed by RT-PCR and Western blot. The effect of GA-A on the proliferation and invasion capability of U251 cells was determined by CCK-8 and transwell assay in vitro，respectively. Flow cytometry was used to detect the influence of GA-A on the cell cycle and apoptosis of U251 cells，and TUNEL staining was detected the cell apoptosis too. Results Compared with the control group，KDR mRNA and protein expression of high concentration and low concentration group were significantly decreased（P＜0. 05），GA-A cansignificantly reduce the cell growth rate，reduce the proportion of cells in G1 phase and increase the proportion of S phase and G2 / M phase，cells apoptosis was significantly increased in the high concentration and low concentration group（P＜0. 01），and cells proliferation and invasion was significantly decreased（P＜0. 05）. Compared with low concentration group，the high concentration group induce cell apoptosis and inhibit the expression of KDR more significant（P＜0. 05）. Conclusions Ganoderma acid A can induce apoptosis in U251 cells，inhibit proliferation and invasion，and can inhibit the expression of KDR mRNA and protein，which may be one of the mechanisms of anti-tumor.

【Key words】Ganoderma acid A；Glioma cells；Vascular endothelial growth factor receptor；Cell cycle；Apoptosis

【中圖分類號】R739-45 R-332

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0064-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 013

［作者簡介］劉海鵬（1980－），男，碩士生，研究方向：膠質(zhì)瘤，郵箱：liuhaipengjzl@163. com。

［通訊作者］單小松，E-mail：zhjianjun_123@163. com。