陳意偉， 溫肖會(huì)， 朱學(xué)良， 呂殿紅， 翟少倫*， 魏文康*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

?

犬博卡病毒PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用

陳意偉1,2， 溫肖會(huì)2， 朱學(xué)良2， 呂殿紅2， 翟少倫2*， 魏文康2*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

摘要[目的]建立犬博卡病毒(Canine bocavirus，CBoV)的PCR檢測(cè)方法，了解其流行情況。[方法]根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上CBoV的VP2基因序列合成1對(duì)引物，建立PCR檢測(cè)方法，并運(yùn)用該方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]特異性試驗(yàn)中，除CBoV有目的條帶出現(xiàn)外，犬細(xì)小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬傳染性肝炎(ICHV)、犬副流感病毒(CPIV)、貓瘟熱(FDV)等均無(wú)條帶出現(xiàn)。敏感性試驗(yàn)表明，此檢測(cè)方法對(duì)CBoV的最低檢測(cè)量為4.806 2 pg/μL。重復(fù)性試驗(yàn)表明，多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，表明此方法重復(fù)性好。425份樣品中僅有1份樣品擴(kuò)增出目的條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)鑒定為CBoV。初步的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，CBoV在犬中的流行率與感染率極低。[結(jié)論]建立的PCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞犬博卡病毒；PCR檢測(cè)方法；應(yīng)用

犬博卡病毒(Canine bocavirus，CBoV)隸屬細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科博卡病毒屬，為單股線狀無(wú)囊膜的DNA病毒。2005年，瑞典學(xué)者Allander等[1]從1份嬰幼兒病例樣本中分離并鑒定出此種病毒，命名為人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)。后來，牛博卡病毒、犬博卡病毒、豬博卡病毒、大猩猩博卡病毒、黑猩猩博卡病毒相繼被發(fā)現(xiàn)[1-2]。雖然博卡病毒最先在患有肺炎的嬰幼兒上呼吸道中被檢測(cè)到，但后來的大量樣品檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹瀉樣品中博卡病毒的陽(yáng)性率更高[3]。博卡病毒可感染并導(dǎo)致宿主發(fā)生急性腹瀉[3-7]。近年來，人博卡病毒(HBoV)和豬博卡病毒(PBoV)各種基因型的分離與鑒定、檢測(cè)方法、流行病學(xué)調(diào)查等日趨成熟全面[7-18]。犬博卡病毒(CBoV)在這些方面的研究資料比較欠缺[19-22]。為了解CBoV在犬類中的流行情況，筆者建立了犬博卡病毒的PCR檢測(cè)方法，并應(yīng)用此檢測(cè)方法對(duì)廣州地區(qū)犬博卡病毒的流行情況進(jìn)行初步調(diào)查，旨在為今后CBoV的研究提供一些依據(jù)。

1材料與方法

1.1重組質(zhì)粒、病毒及樣品含有CBoV-VP2基因的重組質(zhì)粒，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所診斷中心構(gòu)建；犬細(xì)小病毒(CPV)由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所生物技術(shù)中心提供；犬瘟熱病毒(CDV)、犬傳染性肝炎(ICHV)、犬副流感病毒(CPIV)以及貓瘟熱(FDV)細(xì)胞分離上清液由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所動(dòng)物疫病診斷中心保存、樣品由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所動(dòng)物疫病診斷中心采集保存。所有DNA提取均按照AXYGEN公司的核酸提取試劑盒說明操作。

1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的犬博卡VP2基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物為5′-TTCTTTTTCCTTTGACTGCGGG-3′；下游引物為5′-GCGAGTGTGCGTCTAATCTGCT-3′，目的片段大小為410 bp，交由上海生工生物工程股份有限公司廣州分部合成。

1.3標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建經(jīng)CBoV-VP2引物擴(kuò)增出的基因目的序列，用E.Z.N.A Gel Extraction Kit純化，產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞，再交由上海生工生物工程股份有限公司廣州分部測(cè)序。

1.4PCR方法的建立

1.4.1PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA模板 3 μL、上下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

(1)退火溫度的優(yōu)化。以克隆陽(yáng)性質(zhì)粒為DNA模板，退火溫度設(shè)置為52～60 ℃,根據(jù)擴(kuò)增效果篩選出最佳退火溫度。

(2)引物用量的優(yōu)化。以克隆陽(yáng)性質(zhì)粒為DNA模板，采用不同的引物用量(0.1～2.0 μL)進(jìn)行擴(kuò)增，篩選最佳引物用量。

1.4.2特異性試驗(yàn)。對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，分別擴(kuò)增CDV、CPV、ICHV、CPIV和FDV，以驗(yàn)證該引物的特異性。

1.4.3敏感性試驗(yàn)。用克隆質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)該方法的敏感性。先測(cè)定質(zhì)粒濃度，然后做10倍倍比稀釋擴(kuò)增體系(10-10～100)。

1.4.4重復(fù)性試驗(yàn)。將敏感性試驗(yàn)中所稀釋的每個(gè)倍比數(shù)重復(fù)擴(kuò)增3次以上，以驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

1.5臨床樣品的檢測(cè)從廣州某犬繁育場(chǎng)采集425份糞便樣品，用1 mL PBS液體稀釋后混勻，離心后取上清液，按照AXYGEN公司的核酸提取試劑盒說明操作提取DNA。運(yùn)用優(yōu)化的PCR方法對(duì)采集樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1PCR方法的優(yōu)化

2.1.1退火溫度的優(yōu)化。從圖1可以看出，當(dāng)退火溫度為55 ℃時(shí)擴(kuò)增效果最佳，因此最佳退火溫度為55 ℃。

2.1.2引物用量的優(yōu)化。從圖2可以看出，當(dāng)引物用量為1.0 μL時(shí)擴(kuò)增效果最佳，因此最佳引物用量為1.0 μL。

注：M.DL2000 DNA Marker；1.60 ℃；2.59.4 ℃；3.58.4 ℃；4.56.9 ℃；5.55.1 ℃；6.53.5 ℃；7.52.5 ℃；8.52 ℃。Note：M.DL 2 000 DNA Marker; 1.60 ℃; 2.59.4 ℃; 3.58.4 ℃; 4.56.9 ℃; 5.55.1 ℃; 6.53.5 ℃; 7.52.5 ℃; 8.52 ℃.圖1　退火溫度的優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The optimization results of annealing temperature

注：M.DL2000 DNA Marker;1～20依次為0.1～2.0 μL。Note：M.DL 2000 DNA Marker; 1～20.0.1～2.0 μL.圖2　引物用量的優(yōu)化結(jié)果Fig.2　The optimization results of primer dosage

注:M.DL2000 DNA Marker；1.CDV;2.CPV;3.ICHV;4.CPIV;5.FDV;6.CBoV。Note：M.DL2000 DNA Marker; 1.CDV; 2.CPV; 3.ICHV; 4.CPIV; 5.FDV; 6.CBoV.圖3　特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3　The specific test results

因此，PCR的最優(yōu)反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.2特異性試驗(yàn)運(yùn)用以上優(yōu)化的PCR方法分別擴(kuò)增CDV、CPV、ICHV、CPIV、FDV和CBoV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有CBoV可以擴(kuò)增出目的片段，表明該P(yáng)CR方法具有良好的特異性(圖3)。

2.3敏感性試驗(yàn)克隆質(zhì)粒的初始濃度為480.62 ng/μL，對(duì)其進(jìn)行10倍倍比稀釋(10-10-100)，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)DNA的最低檢測(cè)量為4.806 2 pg/μL(圖4)。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)將敏感性試驗(yàn)中的每個(gè)倍比數(shù)重復(fù)擴(kuò)增3次以上，結(jié)果均一致，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.5臨床樣品的檢測(cè)運(yùn)用優(yōu)化后的PCR方法對(duì)臨床采集的425份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有1份為陽(yáng)性，經(jīng)測(cè)序鑒定為CBoV。

3討論與結(jié)論

迄今為止，研究表明博卡病毒對(duì)動(dòng)物具有致病性，但同時(shí)也有研究人員從健康犬中檢測(cè)到博卡病毒[23]。自2005年博卡病毒被發(fā)現(xiàn)以來，國(guó)內(nèi)對(duì)博卡病毒的研究大多集中在人博卡病毒和豬博卡病毒，犬博卡病毒在這方面的研究甚少。該研究中優(yōu)化的PCR檢測(cè)方法對(duì)犬博卡病毒的最低檢測(cè)量

注：M.DL2000 DNA Marker；1.100;2.10-1;3.10-2;4.10-3;5.10-4;6.10-5;7.10-6;8.10-7;9.10-8;10.10-9;11.10-10。Note: M.DL2000 DNA Marker; 1.100; 2.10-1; 3.10-2; 4.10-3; 5.10-4; 6.10-5; 7.10-6; 8.10-7; 9.10-8; 10.10-9;11.10-10.圖4　敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4　The sensitivity test results

為4.806 2 pg/μL，在425份被檢樣品中沒有出現(xiàn)任何非特異性條帶，表明該檢測(cè)方法具有良好的特異性。在初步的流行病學(xué)調(diào)查中，425份樣品中僅檢測(cè)出1份為陽(yáng)性，此次檢測(cè)的樣品采集時(shí)間為8～12月。其中，被檢出的陽(yáng)性樣品為8月從1只成年貴賓犬的糞便中所采集的。此次初步調(diào)查發(fā)現(xiàn)，博卡病毒目前在犬中的流行率和感染率極低，對(duì)犬暫時(shí)不構(gòu)成致病性。但是，由于采樣對(duì)象和區(qū)域的局限性，并不能說明更大范圍犬博卡病毒的流行情況。

參考文獻(xiàn)

[1] ALLANDER T,TAMMI M T,ERIKSSON M,et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples [J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:12891-12896.

[2] ALLANDER T.Human bocavirus [J].J Clin Virol,2008，41(1):29-33.

[3] ARTHUR J L,HIGGINS G D,DAVIDSON G P,et al.A novel bocavirus associated with acute gastroenteritis in Australian children [J].PLoS Pathog,2009,5(4):1000391.

[4] MENG X J.Emerging and re-emerging swine viruses [J].Transbound Emerg Dis,2012,9(10)：85-102.

[6] MADEC F,ROSE N,GRASLAND B,et al.Post-weaning multisys temic wasting syndrome and other PCV2-related problems in pigs：A 12-year experience [J].Transbound Emerg Dis,2008,55(7)：273-283.

[7] HUANG L,ZHAI S L,CHEUNG A K,et al.Detection of a novel porcine parvovirus,PPV4,in Chinese swine herds [J].Virol J,2010,7：333-338.

[8] 盧艷,李丹地,金玉,等.博卡病毒的檢測(cè)方法概述[J].病毒學(xué)報(bào),2014(3):298-302.

[9] 程衛(wèi)霞.博卡病毒流行病學(xué)、致病性及基因進(jìn)化研究[D].蘭州：蘭州大學(xué),2011.

[10] PILGER D A,CANTARELLI V V,AMANTEA S L,et al.Detection of human bocavirus and human metapneumovirus by real-time PCR from patients with respiratory symptoms in Southern Brazil[J].Memorias do Instituto Oswaldo Cruz,2011,106(1):56-60.

[11] PHAM N T K,TRINH Q D,CHAN-IT W,et al.A novel RT-multiplex PCR for detection of Aichi virus,human parechovirus,enteroviruses,and human bocavirus among infants and children with acute gastroenteritis[J].Journal of virological methods,2010,169(1):193-197.

[12] DINA J,VABRET A,GOUARIN S,et al.Detection of human bocavirus in hospitalised children[J].Journal of paediatrics and child health,2009,45(3):149-153.

[13] CHEN A Y,CHENG F,LOU S,et al.Characterization of the gene expression profile of human bocavirus[J].Virology,2010,403(2):145.

[14] BLOMSTR?M A L,ST?HL K，OKURUT A R，et al.Genetic characterisation of a porcine bocavirus detected in domestic pigs in Uganda[J].Virus genes,2013,47(2):370-373.

[15] CHOI M G,PARK S J,NGUYEN V G,et al.Molecular detection and genetic analysis of porcine bocavirus in Korean domestic swine herds[J].Archives of virology,2014,159(6):1487-1492.

[16] HUANG J H,MOR S K,ERBER J,et al.Detection and characterization of porcine bocavirus in the United States[J].Archives of virology,2014,159:1797.

[17] YOO S J,SUNWOO S Y,KO S S,et al.A novel porcine bocavirus harbors a variant NP gene[J].Springer Plus,2015,4(1):370.

[18] YANG W Z,HUANG C P,DUAN Z J.Identification and characterization of porcine bocavirus episomes[J].Bingdu Xuebao,2012,28(4):418-423.

[19] 閆琰,張茜,馬婧,等.犬博卡病毒非結(jié)構(gòu)基因NP1多克隆抗體的制備與鑒定[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015(4):864-869,890.

[20] LAU S K P,WOO P C Y,YEUNG H C,et al.Identification and characterization of bocaviruses in cats and dogs reveals a novel feline bocavirus and a novel genetic group of canine bocavirus[J].Journal of general virology,2012,93(Pt 7):1573-1582.

[21] PRATELLI A,MOSCHIDOU P.Host range of Canine minute virus in cell culture.[J].Journal of veterinary diagnostic investigation,2012,24(5):981-985.

[22] LI L L,PESAVENTO P A,LEUTENEGGER C M,et al.A novel bocavirus in canine liver[J].Virology journal,2013,10(2):1-4.

[23] SHAN T L,LAN D L,LI L L,et al.Genomic characterization and high prevalence of bocaviruses in swine [J].PLoS One,2011,6(4):17292.

Establishment and Application of a PCR Detection Method for Canine Bocavirus

CHEN Yi-wei1,2,WEN Xiao-hui2,ZHU Xue-liang2,ZHAI Shao-lun2*,WEI Wen-kang2*et al

(1.College of Animal Science,Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070; 2.Institute of Animal Health,Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory of Animal Disease Prevention,Guangzhou,Guangdong 510640)

Abstract[Objective] The aim was to establish canine bocavirus PCR detection method and study its prevalence.[Method] A pair of primers were synthesized according to the sequence of VP2 gene of CBoV on Genbank database,and the PCR detection method was established and was applied for detection of clinical sample.[Result] In specific tests,except for CBoV with the emergence of the band,CPV,CDV,ICHV,CPIV,FDV and so on were not brought to appear.Sensitivity experiments showed that the minimum detection amount of CBoV was 4.806 2 pg/μL.The results of repeated experiments were consistent,indicating that the method was reproducible.Among 425 samples,1 sample was amplified with the target bands,and the result was determined as CBoV.Preliminary epidemiological survey showed that the prevalence rate and infection rate of CBoV in dogs was very low.[Conclusion] The established detection method has characteristics of strong strong specificity,high sensitivity and strong repeatability.

Key wordsCanine bocavirus; PCR detection assay; Application

基金項(xiàng)目廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B090600048,2013B050800022,2013B040300009,2015A040404034,2015B050501007,2015-08020055)。

作者簡(jiǎn)介陳意偉(1990- )，男，湖北襄陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物疫病預(yù)防與診斷。*通訊作者，翟少倫，助理研究員，博士，從事動(dòng)物疫病診斷技術(shù)研發(fā)。*通訊作者，魏文康，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物疫病診斷技術(shù)研發(fā)。

收稿日期2016-03-11

中圖分類號(hào)S 852.65+5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)10-148-02