郭彩霞　江　雪　曾翔俊　陳步星*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，北京 100069)

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STAT3在sRAGE抑制缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡中的作用

郭彩霞1江雪1曾翔俊2陳步星1*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，北京 100069)

【摘要】目的 建立體內(nèi)和體外缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)模型，觀察缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡情況及STAT3蛋白表達(dá)變化；檢測(cè)sRAGE對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡及STAT3的蛋白表達(dá)的影響。方法復(fù)制C57BL/6J小鼠心臟和原代心肌細(xì)胞缺血再灌注模型，在sRAGE和(或)STAT3抑制劑AG490的干預(yù)下，通過(guò)檢測(cè)TUNEL及caspase-3活性評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡的程度；通過(guò)Western blotting檢測(cè)磷酸化的STAT3(p-STAT3)及總的STAT3(t-STAT3)蛋白的表達(dá)。結(jié)果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，與Sham組相比，I/R組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和caspase-3活性分別增加了115%和120%，I/R組p-STAT3/STAT3比值降低了50%，sRAGE降低了I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，包括TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目降低了51%，caspase-3活性降低了36%，此外，sRAGE預(yù)處理I/R組的p-STAT3/STAT3比值增加了381%； 體外實(shí)驗(yàn)，與Control組相比，I/R組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和caspase-3活性分別增加了380%和77%，I/R組p-STAT3/STAT3比值降低了69%，sRAGE(900 ng/mL) 同樣降低了I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目降低了63%，caspase-3活性降低了33%，此外，sRAGE預(yù)處理I/R組的p-STAT3/STAT3比值增加了243%，與I/R+sRAGE組相比較，I/R+sRAGE+AG490組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目升高了126%，caspase-3活性增加了42%，p-STAT3/STAT3比值降低了68%。結(jié)論sRAGE可通過(guò)激活STAT3抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】sRAGE；心肌缺血再灌注；凋亡；STAT3

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)是目前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一，再灌注治療是目前最有效的治療手段，隨著冠狀動(dòng)脈介入和搭橋等治療手段的飛速提高，患者預(yù)后明顯改善，但會(huì)引起致命的缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion，I/R)。心肌I/R 損傷是心肌I/R 后所致的心肌結(jié)構(gòu)改變和功能障礙進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，表現(xiàn)為心肌收縮能力降低、再灌注性心律失常的發(fā)生、心肌能量代謝的減弱及心肌結(jié)構(gòu)的破壞等[1-2]，嚴(yán)重降低了冠心病的救治及其預(yù)后。因此，進(jìn)行干預(yù)挽救缺血心肌的同時(shí)，最大限度的減少與預(yù)防再灌注導(dǎo)致新的心肌細(xì)胞損傷、保護(hù)健存心肌是當(dāng)前需要攻克的重大難關(guān)。

目前有一些預(yù)防及治療心肌I/R 損傷的干預(yù)措施，如提高心肌氧和能量供應(yīng)、減輕心臟負(fù)擔(dān)和降低能量消耗等外源性方法；而抑制心肌I/R 損傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制備受關(guān)注，其中包含缺血預(yù)處理和藥物預(yù)處理[3-4]，其中，藥物預(yù)處理的概念，即用藥物刺激或模擬機(jī)體內(nèi)源性抗損傷方式，主要是通過(guò)影響內(nèi)源性物質(zhì)的釋放減輕術(shù)中及術(shù)后的心肌炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等病理?yè)p傷而發(fā)揮保護(hù)作用。

sRAGE 是高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end-products，RAGE)的異構(gòu)體，二者有共同的配基結(jié)合位點(diǎn)。sRAGE具有“誘餌”的作用，即可以結(jié)合RAGE的配體，但不會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)，從而起到阻斷AGEs-RAGE通路而發(fā)揮保護(hù)作用[5]。RAGE屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面多配基信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。RAGE分布廣泛，如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、周細(xì)胞、神經(jīng)元等均可表達(dá)。

本課題組前期研究[6]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在大鼠缺血再灌注模型外周血中sRAGE明顯降低。外源性給予sRAGE可減少體外復(fù)制的缺氧/復(fù)氧模型心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔mPTP的開(kāi)放，使線粒體膜電位去極化程度減輕，提高缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的存活率[6]。本研究選擇復(fù)制動(dòng)物心臟和心肌細(xì)胞缺血再灌注模型，進(jìn)一步觀察sRAGE對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用的具體機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑

DeadEndTM TUNEL熒光法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)的Promega公司；DAPI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；caspase-3 活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)的BioVision公司；蛋白定量BCA試劑盒、組織裂解液及脫脂奶粉均購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；sRAGE購(gòu)自北京愛(ài)迪博生物科技有限公司；AG490及Tween-20購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；總的和磷酸化的STAT3抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell signaling Technology公司；羊抗鼠IgG抗體-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.1.2動(dòng)物

6～8周的雄性C57BL/6小鼠和新生(24 h以?xún)?nèi))的SD大鼠乳鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.1.3儀器及設(shè)備

小動(dòng)物心臟超聲儀器Vevo770(Visual Sonics公司，加拿大)；小動(dòng)物麻醉機(jī)XGI-8(Caliper公司，美國(guó))；CM1950石蠟切片機(jī)(Leica 公司，德國(guó))；DIAX900勻漿儀(Heidolph公司，德國(guó))；Olympus BX51熒光顯微鏡(奧林巴斯公司，美國(guó))；超速低溫離心機(jī)(Sigma公司，美國(guó))；電泳裝置、電轉(zhuǎn)移裝置及凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1在體小鼠心肌缺血再灌注模型的制備

實(shí)驗(yàn)采用23～25g健康雄性C57BL/6小鼠，2%(體積分?jǐn)?shù))異氟烷吸入麻醉。開(kāi)胸，胸骨左側(cè)2 mm切開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉見(jiàn)肋骨，在第4肋間隙用眼科剪輕輕向下分離肋間肌，向上伸入血管鉗反復(fù)夾閉兩根肋骨以減少出血。用拉鉤拉開(kāi)胸壁，暴露心臟，在左心耳下緣3～4 mm進(jìn)針，進(jìn)針深約1.5 mm，斜向右上方肺動(dòng)脈圓錐方向出針，針距約3～4 mm，結(jié)扎和松開(kāi)冠狀動(dòng)脈左前降支，采用缺血30 min后再灌注24 h復(fù)制缺血/再灌注模型[7]。假手術(shù)組采取相同的手術(shù)方式，但是不結(jié)扎血管。術(shù)前12 h及術(shù)后12 h分別腹腔注射sRAGE，等體積的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液溶解藥物，100 μg/只[8]。再灌注24 h后進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)心功能。

實(shí)驗(yàn)分組： Sham組：血管置線但不結(jié)扎(n=3)，術(shù)前和術(shù)后12 h分別腹腔注射等體積的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液；Sham+sRAGE組：術(shù)前和術(shù)后12 h分別腹腔注射sRAGE，100 μg/只，余處理同Sham組(n=3)。I/R組：結(jié)扎左前降支30 min，再灌注24 h，術(shù)前和術(shù)后12 h分別腹腔注射等體積的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(n=3)。I/R+sRAGE組：術(shù)前和術(shù)后12 h分別腹腔注射sRAGE，100 μg/只，余處理同I/R組(n=3)。

1.2.2原代心肌細(xì)胞缺血再灌注模型的制備

正常培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞72 h后，應(yīng)用“缺血buffer”(pH 6.3)代替DMEM培養(yǎng)基刺激細(xì)胞復(fù)制缺血模型[9]，缺血buffer 包含以下物質(zhì): 118 mmol/L NaCl， 24 mmol/L NaHCO3， 1.0 mmol/L NaH2PO4， 2.5 mmol/L CaCl2·2H2O， 1.2 mmol/L MgCl2， 20 mmol/L 乳酸鈉， 16 mmol/L KCl 和 10 mmol/L脫氧葡萄糖。將缺血buffer加入實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)孔，2 mL/孔，然后將細(xì)胞放在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，2 h后將缺血buffer換為無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基再持續(xù)灌注24 h。對(duì)于對(duì)照組，心肌細(xì)胞一直培養(yǎng)在無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中。

實(shí)驗(yàn)分組：(1)對(duì)照組(Control)： DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞；(2)Control+sRAGE(Control+sRAGE)組： DMEM完全培養(yǎng)基中加入sRAGE[6]，余處理同Control組；(3)Control+AG490(Control+AG490)組：DMEM完全培養(yǎng)基中加入AG490[10]，余處理同Control組； (4)缺血再灌注(I/R)組：缺血buffer替代DMEM完全培養(yǎng)基，使心肌細(xì)胞缺血2 h，后將缺血buffer更換為DMEM完全培養(yǎng)基，使心肌細(xì)胞再灌注24 h；(5)缺血再灌注+sRAGE(I/R+sRAGE)組：缺血前10 min DMEM完全培養(yǎng)基中加入sRAGE(900 nmol/L)，余處理同I/R組。(6)缺血再灌注+sRAGE+AG490(I/R+sRAGE+AG490)組：缺血前30 min和10 min DMEM完全培養(yǎng)基中分別加入AG490(5μmol/L)和sRAGE(900 ng/mL)，余處理同I/R組。

1.2.3心肌組織及心肌細(xì)胞的TUNEL及caspase-3活性檢測(cè)

石蠟包埋的心臟組織切成4～5 μm厚度，經(jīng)過(guò)脫蠟入水、固定及通透等過(guò)程后，離體心肌細(xì)胞則經(jīng)4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲醛固定后，將樣品37 ℃避光孵育在rTdT緩沖液中1 h，清洗、固定，DAPI染核，固定、抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察、照相，以凋亡細(xì)胞核數(shù)占總細(xì)胞核數(shù)的百分比作為細(xì)胞凋亡率[11]。熒光法檢測(cè)caspase-3的活性，樣品在缺血buffer的作用下裂解，14 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，樣品上清液及熒光底物加入96孔板，0 min測(cè)定基礎(chǔ)值，37 ℃避光孵育1.5 h后再次讀取數(shù)值，熒光計(jì)的最佳波長(zhǎng)為405 nm。同時(shí)BCA法測(cè)定各組織的蛋白濃度，2次讀取的數(shù)值之差除以各自的蛋白濃度即為caspase-3活性[12]。

1.2.4組織和細(xì)胞STAT3蛋白的表達(dá)檢測(cè)

心肌組織加入RIPA裂解液(20 mg加0.2 mL)，同時(shí)加入PMSF(1∶100)，勻漿器進(jìn)行勻漿，冰上孵育30 min，4 ℃下12 500 r/min，離心15 min，上清液測(cè)蛋白濃度及蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶封閉60 min，3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶孵育總泛素蛋白一抗(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜后，室溫孵育羊抗鼠IgG抗體-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗60 min，凝膠成像系統(tǒng)成像[13]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1心肌組織中TUNEL及caspase-3活性的改變

Sham組與Sham+sRAGE組TUNEL陽(yáng)性心肌細(xì)胞極少，兩組間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(4.5±0.4)%vs(2.9±0.3)%，P>0.05)]。與Sham組相比，I/R組細(xì)胞凋亡率明顯增加了115%[(36.3±1.5)%vs(2.9±0.3)%，P<0.05)]。與I/R組相比，I/R+sRAGE組細(xì)胞凋亡率明顯降低了51%[(17.8±0.7)%vs(36.3±1.5)%，P<0.05)](圖1A、B)。

Sham組與Sham+sRAGE組間caspase-3活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.0±0.1)%vs(1.1±0.2)%，P>0.05)]。與Sham組相比，I/R組caspase-3活性明顯升高了120%[(2.2±0.5)%vs(1.0±0.1)%，P<0.05)]。與I/R組相比，I/R+sRAGE組caspase-3活性明顯從(2.2±0.5)%降低至(1.4±0.2)% (P<0.05) (圖1C)。

2.2組織STAT3的蛋白表達(dá)

與Sham組相比較，I/R組p-STAT3/STAT3比值降低了50% (0.17±0.11vs0.35±0.03，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與I/R組相比較，sRAGE預(yù)處理I/R組的p-STAT3/STAT3比值增加了381% (0.84±0.16vs0.17±0.11，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，與Sham組相比較，sRAGE預(yù)處理Sham組的p-STAT3/STAT3升高了85% (0.64±0.13vs0.35±0.03，P<0.05) (圖2)。

圖1　小鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)

A：representative photomicrographs of TUNEL-stained myocardium sections from wild-type (WT) exposed to sham operation or ischemia-reperfusion (I/R). TUNEL-positive nuclei (green)， myoglobin (red)， and DAPI (blue); Scale bar: 50 μm. B：quantitative analysis of apoptosis;n=3-4 per group. C：myocardial cell apoptosis was determined by caspase-3 activity assay in sham， sham+ sRAGE and experimental mice 24 h after I/R injury from different groups; Values are expressed as means±SE.*P<0.05vssham group，#P<0.05vsI/R group； sRAGE:soluble receptor for advanced glycation end products； I/R:ischemia/reperfusion.

圖2　小鼠心肌凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

A：Western blotting analysis for p-STAT3 and t-STAT3. B：quantitative analysis of p-STAT3 to t-STAT3.n=3-4 per group. Values are expressed as means±SE.*P<0.05vssham group，#P<0.05vsI/R group； sRAGE:soluble receptor for advanced glycation end products； I/R:ischemia/reperfusion.

2.3 原代心肌細(xì)胞中TUNEL及caspase-3活性的改變

Control組與Control+sRAGE組間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.1±0.2)%vs(1.0±0.1)%，P>0.05)]，Control組與Control+AG490組間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.1±0.3)%vs(1.0±0.1)%，P>0.05)]；與Control組相比，I/R組細(xì)胞凋亡率明顯增加[(3.8±0.9)%vs(1.0±0.1)%，P<0.05)]；與I/R組相比，I/R+sRAGE組細(xì)胞凋亡率明顯降低[(1.4±0.6)%vs(3.8±0.9)%，P<0.05)]；與I/R+sRAGE組相比較，I/R+sRAGE+AG490組細(xì)胞凋亡率明顯升高[(3.2±0.7)%vs(1.4±0.6)%，P<0.05)](圖3A、B)。

Control組與Control+sRAGE組間caspase-3活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.9±0.1)%vs(1.0±0.1)%，P>0.05)]；Control組與Control+AG490組間caspase-3活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.0±0.3)%vs(1.0±0.1)%，P>0.05)]；與Control組相比，I/R組caspase-3活性明顯升高了77%[(1.8±0.5)%vs(1.0±0.1)%，P<0.05)]；與I/R組相比，I/R+sRAGE組caspase-3活性明顯從(1.8±0.5)%降低至(1.2±0.4)% (P<0.05)；與I/R+sRAGE組相比，I/R+sRAGE+AG490組caspase-3活性從(1.2±0.4)%升高至(1.7±0.3)% (P<0.05) (圖3C)。

2.4原代心肌細(xì)胞中STAT3的蛋白表達(dá)

與Control組相比較，I/R組p-STAT3/STAT3比值降低了69% (0.18±0.09vs0.60±0.05，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與I/R組相比較，sRAGE預(yù)處理I/R組的p-STAT3/STAT3比值增加了243% (0.63±0.14vs0.18±0.09，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與I/R+sRAGE組相比較，I/R+sRAGE+AG490組p-STAT3/STAT3比值降低了68% (0.20±0.11vs0.63±0.14，P<0.05)。另外，與Control組相比較，sRAGE預(yù)處理Sham組的p-STAT3/STAT3升高了20% (0.72±0.14vs0.60±0.05，P<0.05)；與Control組相比較，Control+AG490組 p-STAT3/STAT3比值降低了34% (0.40±0.10vs0.60±0.05，P<0.05) (圖4)。

圖3　體外心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)

A：Representative photomicrographs of TUNEL-stained cardiomyocytes from different groups. TUNEL-positive nuclei (green)， myoglobin (red)， and DAPI (blue). Scale bar，100 μm.B：Quantitative analysis of TUNEL-positive cells was shown for different groups.C: quantitative analysis of caspase-3 activity was shown for different groups. Values were expressed as means±SE for three independent experiments.*P<0.05vscontrol group，#P<0.05vsI/R group，$P<0.05vsI/R+sRAGE group； sRAGE: soluble receptor for advanced glycation end products； I/R:ischemia/reperfusion.

圖4　體外心肌凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

A：Western blotting analysis for p-STAT3 and t-STAT3. B：quantitative analysis of p-STAT3 to t-STAT3. Values were expressed as means±SE for three independent experiments.*P<0.05vscontrol group，#P<0.05vsI/R group，$P<0.05vsI/R+sRAGE group； sRAGE: soluble receptor for advanced glycation end products； I/R:ischemia/reperfusion； STAT3: signal transducers and activators of transcriptions 3.

3討論

冠心病患者給予再灌注治療后可發(fā)生再灌注心肌損傷，目前關(guān)于缺血再灌注損傷的確切機(jī)制尚未明確，因此，尋找臨床有效干預(yù)以降低缺血再灌注損傷仍然是重要的挑戰(zhàn)[14-17]。內(nèi)源性物質(zhì)的作用備受關(guān)注，其中研究廣泛的內(nèi)源性物質(zhì)之一就是sRAGE，關(guān)于其在心肌缺血再灌注損傷中的研究也逐漸增多，Bucciarelli 等[18]證實(shí)sRAGE 可抑制心肌I/R 時(shí)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)的釋放及改善I/R 導(dǎo)致的心功能降低，此后，Aleshin 等[19]表明sRAGE 可減緩小鼠心肌I/R 炎性反應(yīng)、減少梗死面積、抑制細(xì)胞色素C 的釋放及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducers and activators of transcriptions 3，STAT3)活性的降低。國(guó)內(nèi)學(xué)者[12]利用豬心肌I/R 模型證實(shí)sRAGE可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表達(dá)而抑制I/R后心肌重構(gòu)，這些研究均表明，sRAGE具有心臟保護(hù)作用，究其保護(hù)機(jī)制，本課題組前期研究[6]表明，sRAGE的心肌保護(hù)作用主要是通過(guò)抑制I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

心肌細(xì)胞在I/R 過(guò)程中主要有凋亡和壞死兩種死亡方式。細(xì)胞凋亡是心肌I/R損傷的主要途徑。凋亡主要由長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)缺血或再灌注階段誘發(fā)，貫穿于再灌注早期的起始階段、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的中間階段及數(shù)月之后的延遲階段，介導(dǎo)I/R 后心肌梗死范圍擴(kuò)大、心室重塑及心力衰竭等I/R 損傷的發(fā)生。缺血后再灌早期，再灌損傷搶救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)通路激活，包括PI3K/Akt和Erk1/2 MAPK等，而JAK/STAT可通過(guò)PI3K/Akt啟動(dòng)RISK通路的激活。因此，STAT在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，主要通過(guò)將細(xì)胞表面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核中，從而調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)。Aleshin等[19]證實(shí)RAGE-/-和sRAGE處理的小鼠I/R心肌組織中STAT3磷酸化水平明顯增強(qiáng)，同時(shí)明顯減輕RAGE介導(dǎo)的心肌損傷，提示sRAGE可通過(guò)激活STAT3發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，I/R可明顯降低STAT3的磷酸化水平，增加TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及caspase-3活性，而sRAGE預(yù)處理后可明顯抑制I/R導(dǎo)致的STAT3的磷酸化水平的降低及心肌細(xì)胞的增加，STAT3抑制劑AG490可減弱上述的sRAGE抗凋亡作用。

sRAGE能夠激活STAT3，而sRAGE本身無(wú)跨膜段，因此提示sRAGE可能通過(guò)激活其他細(xì)胞因子進(jìn)而調(diào)節(jié)STAT3的活性而發(fā)揮保護(hù)作用，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4參考文獻(xiàn)

[1]Qian W， Xiong X， Fang Z， et al. Protective effect of tetramethylpyrazine on myocardial ischemia-reperfusion injury[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2014， 2014:107501.

[2]Badalzadeh R， Yousefi B， Majidinia M， et al. Anti-arrhythmic effect of diosgenin in reperfusion-induced myocardial injury in a rat model: activation of nitric oxide system and mitochondrial KATP channel[J]. J Physiol Sci， 2014， 64(6):393-400.

[3]Vinten-Johansen J， Shi W. The science and clinical translation of remote postconditioning[J]. J Cardiovasc Med (Hagerstown)， 2013， 14(3):206-213.

[4]Szentmiklosi A J， Cseppento A， Harmati G， et al. Novel trends in the treatment of cardiovascular disorders: site-and event-selective adenosinergic drugs[J].Curr Med Chem， 2011， 18(8):1164-1187.

[5]Yan S F， Ramasamy R， Schmidt A M. Soluble RAGE: therapy and biomarker in unraveling the RAGE axis in chronic disease and aging[J].Biochem Pharmacol， 2010， 79(10):1379-1386.

[6]Guo C， Zeng X， Song J， et al. A soluble receptor for advanced glycation end-products inhibits hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in rat cardiomyocytes via the mitochondrial pathway[J]. Int J Mol Sci， 2012， 13(9):11923-11940.

[7]Pan Z， Sun X， Ren J， et al. miR-1 exacerbates cardiac ischemia-reperfusion injury in mouse models[J].PLoS One， 2012， 7(11):e50515.

[8]Shang L， Ananthakrishnan R， Li Q， et al. RAGE modulates hypoxia/reoxygenation injury in adult murine cardiomyocytes via JNK and GSK-3beta signaling pathways[J]. PLoS One，2010， 5(4):e10092.

[9]Das A， Xi L， Kukreja R C. Phosphodiesterase-5 inhibitor sildenafil preconditions adult cardiac myocytes against necrosis and apoptosis. Essential role of nitric oxide signaling[J]. J Biol Chem， 2005， 280(13):12944-12955.

[10]Smith C C， Dixon R A， Wynne A M， et al. Leptin-induced cardioprotection involves JAK/STAT signaling that may be linked to the mitochondrial permeability transition pore[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010， 299(4):H1265-1270.

[11]Yin T， Hou R， Liu S， et al. Nitrative inactivation of thioredoxin-1 increases vulnerability of diabetic hearts to ischemia/reperfusion injury[J]. J Mol Cell Cardiol， 2010， 49(3):354-361.

[12]Wang K， Zhang J， Liu J， et al. Variations in the protein level of Omi/HtrA2 in the heart of aged rats may contribute to the increased susceptibility of cardiomyocytes to ischemia/reperfusion injury and cell death: Omi/HtrA2 and aged heart injury[J]. Age (Dordr)，2013，35(3):733-746.

[13]Yang K， Zhang T P， Tian C， et al. Carboxyl terminus of heat shock protein 70-interacting protein inhibits angiotensin II-induced cardiac remodeling[J]. Am J Hypertens，2012， 25(9):994-1001.

[14]Eltzschig H K， Eckle T. Ischemia and reperfusion—from mechanism to translation[J]. Nat Med，2011， 17(11):1391-1401.

[15]熊瑞媛, 田煒,楊方. 細(xì)胞凋亡途徑在心肌缺血/再灌注損傷中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志， 2015，18(3)：512-515.

[16]唐麗敏, 賀永貴,張義東,等. 心肌缺血/再灌注損傷發(fā)生機(jī)制及其保護(hù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2013，16(1)：159-161.

[17]王夢(mèng)然, 張健,梁艷紅,等. 缺血后處理對(duì)老年大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(1)：132-136.

[18]Bucciarelli L G， Kaneko M， Ananthakrishnan R， et al. Receptor for advanced-glycation end products: key modulator of myocardial ischemic injury[J]. Circulation，2006，113(9):1226-1234.

[19]Aleshin A， Ananthakrishnan R， Li Q， et al. RAGE modulates myocardial injury consequent to LAD infarction via impact on JNK and STAT signaling in a murine model[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008， 294(4):H1823-1832.

編輯陳瑞芳

Effect of STAT3 in soluble receptor for advanced glycation end-products inhibiting myocardial apoptosis induced by ischemia/reperfusion

Guo Caixia1， Jiang Xue1，Zeng Xiangjun2， Chen Buxing1*

(1.DepartmentofCardiology，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China；2.DepartmentofPathophysiology，SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

【Abstract】ObjectiveTo test the effect of sRAGE on myocardial apoptosis and STAT3 protein expression with or without STAT3 inhibitor AG490 following ischemia/reperfusion in vivo and in vitro. MethodsC57BL/6J mice undergone left anterior descending coronary artery ligation were used as in vivo model and neonatal rat cardiomyocyte subjected to ischemic buffer as an in vitro model. Apoptosis was detected by TUNEL staining and caspase-3 activity. Expression of STAT3/p-STAT3 protein were detected by Western blotting analysis in the presence and absence of the JAK2 inhibitor AG 490. ResultsIn vivo， compared with sham group， the number of TUNEL positive cells and caspase-3 activity were increased by 115% and 120%， and the ratio of p-STAT3/STAT3 was reduced by 50%； sRAGE (100 μg/day) reduced the TUNEL-positive myocytes by 51%， and activity of caspase-3 by 36%， increased the ratio of p-STAT3/STAT3 by 381% followed by I/R. In vitro， compared with control group， the number of TUNEL positive cells and caspase-3 activity increased by 380% and 77%， and the ratio of p-STAT3/STAT3 was reduced by 69%， sRAGE (900 ng/mL) reduced the TUNEL-positive myocytes by 63%， and caspase-3 activity by 33%， increased the ratio of p-STAT3/STAT3 by 243% followed by I/R. The effect of sRAGE reduction on TUNEL-positive myocytes and caspase-3 activity， raise of the ratio of p-STAT3/STAT3 were attenuated by STAT3 inhibitor AG490. ConclusionThese results suggest that sRAGE protects cardiomyocytes from apoptosis induced by I/R in vitro and in vivo by activating STAT3.

【Key words】sRAGE； myocardial ischemia/reperfusion； apoptosis； STAT3

(收稿日期：2015-12-10)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 541.4

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.009]

*Corresponding author， E-mail：chbux@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81570321， 81370313)，北京市科技新星計(jì)劃(2010B050)，北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計(jì)劃(2013-3-046)資助項(xiàng)目。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81570321， 81370313)，Beijing NOVA Program(2010B050)， Beijing Health System High Level Health Technical Personnel Training Plan(2013-3-046)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-2718∶00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1800.026.html

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