陳沛，宋俊，李春麗，張鄂，羅凌惠，肖紅俊，龔樹生

大鼠面神經(jīng)損傷修復(fù)晚期面神經(jīng)核的基因表達(dá)譜

陳沛1，宋俊2，李春麗1，張鄂1，羅凌惠3，肖紅俊3，龔樹生4

目的：篩選外周損傷修復(fù)晚期面神經(jīng)核區(qū)的差異表達(dá)基因。方法：建立大鼠面神經(jīng)斷傷吻合模型，90 d后準(zhǔn)確解剖定位獲取健患兩側(cè)面神經(jīng)核組織的總RNA，再以其逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板轉(zhuǎn)錄生成生物素標(biāo)記的cRNA，純化與片段化后形成探針并與大鼠基因表達(dá)譜芯片雜交，掃描儀檢測信號后用生物學(xué)分析軟件篩選差異表達(dá)基因并作初步功能分析。結(jié)果：基因芯片檢測表明，患側(cè)面神經(jīng)核區(qū)檢出1 660個基因，健側(cè)檢出1 683個基因，與健側(cè)相比篩選出差異基因300個，其中上調(diào)157個（差異倍數(shù)≥2），下調(diào)143個（差異倍數(shù)≤-2）。GO分析電子功能注釋發(fā)現(xiàn)，差異基因功能涉及代謝反應(yīng)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子、信號傳遞等。KEGG信號通路分析篩選出最可能相關(guān)的信號通路32個（P＜0.05），包括白細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運、黏著斑激酶途徑等。結(jié)論：基因表達(dá)譜分析表明多基因、多信號通路參與外周損傷修復(fù)晚期面神經(jīng)核內(nèi)的塑形活動。

損傷修復(fù)；面神經(jīng)核；基因芯片

外傷、手術(shù)、炎癥或腫瘤均可引起面神經(jīng)損傷而導(dǎo)致面癱，修復(fù)治療后也常伴發(fā)鱷魚淚、聯(lián)帶運動、面肌痙攣等面癱后遺癥，所造成的容貌損害及功能障礙嚴(yán)重影響患者的生活、工作、社交與心理健康。面運動神經(jīng)元接受、傳導(dǎo)和整合運動信息，決定著面神經(jīng)損傷后的變性過程與再生質(zhì)量[1,2]。研究表明，外周損傷后面運動神經(jīng)元周圍的突觸傳入、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控、免疫反應(yīng)與膠質(zhì)活動均發(fā)生塑形改變[3-6]。雖然一系列與神經(jīng)元軸突再生相關(guān)的基因被研究發(fā)現(xiàn)[7-11]，但面神經(jīng)核內(nèi)的傷后復(fù)雜的塑形活動涉及多個途徑、多基因改變，目前的研究卻多著眼于外周損傷后一些基因的短期變化，缺乏對損傷修復(fù)晚期面神經(jīng)核內(nèi)基因表達(dá)譜變化的全面分析。基因芯片將傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法與芯片技術(shù)結(jié)合，可在較短時間內(nèi)對大量基因進(jìn)行檢測，故可對較復(fù)雜、多因素的病理生理過程導(dǎo)致的大量基因表達(dá)異常進(jìn)行分析，為研究者提供一個較全面、無偏倚的判斷[12,13]。

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠面神經(jīng)斷傷修復(fù)2月后，無論行為學(xué)與肌電活動均檢測到聯(lián)帶運動[14]。因此，本研究建立大鼠面神經(jīng)斷傷吻合模型，獲取傷后晚期健患兩側(cè)的面神經(jīng)核組織，應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選出差異表達(dá)基因，通過分子生物學(xué)數(shù)據(jù)分析，尋找可能與神經(jīng)再生修復(fù)和后遺癥產(chǎn)生有關(guān)的信號分子及信號路徑，為進(jìn)行相關(guān)深入研究提供有價值的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD雌性成年大鼠6只，體質(zhì)量200～220 g。

1.1.2 主要試劑與儀器 Leica VT1200振動切片機（購于德國Leica公司）。Rat Genome 230 2.0 Array基因表達(dá)譜芯片（購于美國Affymetrix公司）；在線分子注釋系統(tǒng)（Molecule Annotation System，MAS 2.0，購于北京博奧生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 取6只大鼠，常規(guī)10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后于無菌條件下暴露左側(cè)莖乳孔外面神經(jīng)主干，斜行切斷后用11-0無創(chuàng)縫線斷端縫合神經(jīng)外膜兩針，逐層縫合肌肉皮膚，同法處理右側(cè)，但僅暴露面神經(jīng)主干。麻醉蘇醒后，觀察到大鼠左側(cè)觸須失去拂動能力，鼻尖偏向健側(cè)，眼瞼下垂，同時左側(cè)觸須出現(xiàn)細(xì)微纖顫，常伴嗤鼻動作，提示面癱模型建立成功[6,14]。

1.2.2 面神經(jīng)核組織RNA獲取 大鼠飼養(yǎng)至術(shù)后90 d時，麻醉后斷頸取腦并迅速于冰上切取腦干組織，行振動切片機切片，層厚100 μmol/L，至接近腦干腹側(cè)出面神經(jīng)根處時腦片行1%甲苯胺藍(lán)快速染色1 min，顯微鏡下觀察確認(rèn)為含面神經(jīng)根層面后，調(diào)整片厚為500 μmol/L，切1片棄去后留取第2片腦片待用，重新調(diào)整片厚至100 μmol/L，待切取腦片行快速甲苯胺藍(lán)染色確認(rèn)所獲取的500 μmol/L腦片為含面神經(jīng)核團(tuán)組織后，在該腦片上切取距中線1.5 mm、距腹側(cè)水平線1 mm面核區(qū)內(nèi)約1.5×1.5 mm大小組織；同法取健側(cè)面神經(jīng)核組織。利用Trizol試劑盒采用一步法分別提取實驗組與對照組面核腦組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA質(zhì)量，1%瓊脂糖電泳鑒定總RNA完整性。

1.2.3 芯片檢測、數(shù)據(jù)處理和生物學(xué)信息分析 以RNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄依次合成單鏈及雙鏈cDNA，雙鏈cDNA經(jīng)純化后體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記的cRNA，純化后再片段化形成探針。配制好基因芯片雜交液，將雜交液置于加熱塊上，99℃溫育5 min，預(yù)雜交后，將芯片平衡放置于雜交爐中，45℃下60 rpm旋轉(zhuǎn)雜交16 h。應(yīng)用Affymetrix公司流式工作站450和掃描儀3 000進(jìn)行芯片清洗染色和掃描。

用Gcos1.4軟件進(jìn)行單張芯片信號值提取，和dChip 2006軟件中的不變集（invariant 8et）標(biāo)準(zhǔn)化方法對6張芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，按差異表達(dá)水平達(dá)2倍為顯著性標(biāo)準(zhǔn)篩選出表達(dá)差異的基因，利用在線分子注釋系統(tǒng)，對差異基因進(jìn)行基因功能的分類注釋（gene ontology，GO）和信號通路分析（KEGG）。

2 結(jié)果

2.1 獲取面神經(jīng)核組織RNA

依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，在振動切片機切取含面神經(jīng)根層面100 μmol/L腦片后（圖1A-C），切取第2片500 μmol/L厚內(nèi)含面神經(jīng)核組織的腦片，核團(tuán)定位準(zhǔn)確性由隨后所切取的100 μmol/L腦片快速甲苯胺藍(lán)染色證實（圖1D-F，圖1E內(nèi)方框示具體取材部位)。健側(cè)面核區(qū)組織中提取總RNA為（18.5±1.6）μg，患側(cè)面核區(qū)組織中提取總RNA為（21.8±2.1）μg，健患兩側(cè)RNA的OD260/OD280比值在1.95～2.10之間。RNA樣品電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度接近1∶1（圖2），RNA質(zhì)量符合表達(dá)譜芯片實驗要求。

2.2 基因芯片檢測結(jié)果

基因芯片提供的2 800個基因中，患側(cè)檢出1 660個，健側(cè)檢出1 683個。按差異表達(dá)水平達(dá)2倍為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，與健側(cè)芯片數(shù)據(jù)比較篩選出差異基因300個，其中上調(diào)157個（差異倍數(shù)≥2），下調(diào)143個（差異倍數(shù)≤-2）。GO分析電子功能注釋表明，表達(dá)上調(diào)基因功能涉及代謝反應(yīng)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子、信號傳遞等；表達(dá)下調(diào)基因功能涉及細(xì)胞因子、代謝、細(xì)胞粘附、信號傳遞等生物學(xué)過程（表1）。

對差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG信號通路分析，篩選出最可能相關(guān)的信號通路32個（P＜0.05），包括白細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運、鐵離子通道結(jié)合、細(xì)胞因子活動、細(xì)胞粘附分子、損傷反應(yīng)、磷脂酰信號系統(tǒng)、骨架分子活動、局部粘著、生物刺激反應(yīng)等。其中表達(dá)上調(diào)的差異基因RGD1565941_predicted、絨毛蛋白2、claudin 1先后6次參與白細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運途徑，另外3個表達(dá)上調(diào)的差異基因整合素β6、Pip5kia、類VAV3致癌基因則同時參與黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）途徑信號通路。

圖1 大鼠含面神經(jīng)根（A-C）與面神經(jīng)核腦片層面（D-F）

圖2 健患兩側(cè)面神經(jīng)核組織RNA電泳圖

3 討論

本研究提取大鼠健患兩側(cè)面神經(jīng)核區(qū)組織總RNA進(jìn)行基因芯片檢測，所獲取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢證實合格。由此可見，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜解剖知識，采用振動切片結(jié)合快速甲苯胺藍(lán)尼染色方法，可以快速、準(zhǔn)確地定位面神經(jīng)核區(qū)腦組織，從而獲得質(zhì)量可靠的RNA用于下游檢測，為本領(lǐng)域及其它腦研究提供了技術(shù)參考。

本研究選用包含3 100個探針位點、代表2 800個功能明確的大鼠基因的cDNA基因表達(dá)譜芯片，經(jīng)檢測，得到外周損傷修復(fù)晚期大鼠面神經(jīng)核內(nèi)較全面的基因表達(dá)變化信息，有助于推測該差異基因群與神經(jīng)損傷修復(fù)晚期塑形活動與后遺癥產(chǎn)生的可能聯(lián)系。利用MAS2.0系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，差異基因功能涉及白細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運、鐵離子通道結(jié)合、細(xì)胞因子活動、細(xì)胞粘附分子、損傷反應(yīng)、磷脂酰信號系統(tǒng)、骨架分子活動、局部粘著、生物刺激反應(yīng)等，其中大部分尚未見涉及神經(jīng)損傷的詳細(xì)報道。

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）通過和細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞生長、分化、調(diào)亡及誘發(fā)炎癥等多種生物學(xué)效應(yīng)，活躍地參與神經(jīng)損傷修復(fù)活動[15]。TNF超家族2的表達(dá)產(chǎn)物TNF-α可激活Caspase蛋白酶、JNK（Jun kinase）和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB三條信號通路，其中NF-κB促進(jìn)存活，而JNK加速細(xì)胞死亡，TNFa介導(dǎo)的JNK活化可加速NF-κB誘導(dǎo)的Caspase-8的抵制劑、抗調(diào)亡蛋白c-FLIP的逆轉(zhuǎn)[16]。有研究發(fā)現(xiàn)用TNF-α對人唾液腺（human salivary gland,HSG）細(xì)胞進(jìn)行處理后，能促使Fas受體表達(dá)增加，激活Caspase-8進(jìn)而誘導(dǎo)HSG細(xì)胞的凋亡[17]。以往研究表明，大鼠顳外段面神經(jīng)損傷后面運動神經(jīng)元未見明顯凋亡壞死[18,19]。本研究基因芯片檢測結(jié)果表明患側(cè)面核區(qū)細(xì)胞因子TNF在傷后表達(dá)下調(diào)，也再次間接支持凋亡并非外周損傷后面運動神經(jīng)元主要轉(zhuǎn)歸的觀點。

信號通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異基因整合素β6、Pip5kia、類VAV3致癌基因活躍地參與晚期神經(jīng)損傷修復(fù)活動中的FAK信號通路。細(xì)胞粘附分子整合素家族β1與β2于面神經(jīng)損傷后在面運動神經(jīng)元內(nèi)高表達(dá)，可將外周軸突芽生的生長錐局限化[20]。整合素β1在細(xì)胞表面的成簇表達(dá)能夠使FAK在黏著斑部位快速集中并同時發(fā)生自身酪氨酸磷酸化，或通過與細(xì)胞外基質(zhì)中的特殊氨基酸序列結(jié)合，從而激活下游的細(xì)胞遷移信號分子如細(xì)胞骨架蛋白等，引發(fā)細(xì)胞的變形、收縮、粘附和遷移[21,22]。推測整合素β6可與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合從而激活FAK信號途徑，調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞黏附、生長及遷移，通過影響晚期塑形活動而影響神經(jīng)元功能。

表1 差異基因的GO功能注釋結(jié)果

NM-012786細(xì)胞色素C氧化酶8B亞型2.90離子運輸NM-030838溶質(zhì)載體有機陰離子轉(zhuǎn)運家族1a5水通道1脂聯(lián)素18.63 AA891661 BM386227核蛋白體BF419582 AI454360細(xì)胞因子NM-031530 8.47 2.16睪丸表達(dá)基因15乙二醛酶域5 2.39 2.57下調(diào)-2.35 NM-053960 -2.00 AA819227趨化因子(C-C基元)配體2趨化因子(C-C基元)受體5腫瘤壞死因子（TNF超家族2）-2.17代謝相關(guān)L21698 -3.07 AB052846信號傳遞AF041107 UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶8A甾醇C5-脫氫酶-3.83 -2.44 NM-017028 -2.30 X52711 -6.36 NM-033359細(xì)胞粘附NM-053457凝血相關(guān)NM-012532轉(zhuǎn)錄相關(guān)NM-053412 GTP酶激活Ran GAP域樣1粘病毒（流感病毒）抗性蛋白2粘病毒（流感病毒）抗性蛋白1神經(jīng)球蛋白-2.15 claudin 11 -3.00銅藍(lán)蛋白-2.11白介素結(jié)合增強因子-2.09內(nèi)分泌AW524433類RIKEN cDNA 1110038F21 -2.14

神經(jīng)損傷修復(fù)涉及多種靶分子和多條神經(jīng)信號通路，此基因表達(dá)譜芯片雖有高能量的優(yōu)勢，但仍只能著眼于浩大基因庫內(nèi)的一小部分而制約了研究結(jié)果的科學(xué)價值，例如許多差異表達(dá)基因、信號通路在神經(jīng)損傷再生病理機制中的作用尚未明確，也還不清楚這些基因之間的調(diào)控關(guān)系和主次關(guān)系。若能采用更具體的功能分類基因芯片或定制芯片檢測并進(jìn)行下游驗證，將更有助于從基因水平揭示其病理生理過程。

總之，面神經(jīng)損傷修復(fù)過程涉及多因素、多途徑的參與，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測傷后晚期面神經(jīng)核基因表達(dá)譜的變化，可為研究闡明面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核內(nèi)塑形變化與面癱后遺癥的產(chǎn)生機制提供新思路。

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（本文編輯：王晶）

Late Gene Expression Profiles of Facial Nucleus in Rat Following Facial-facial Anastomosis

CHEN Pei1,SONG Jun2,LI Chun-li1,ZHANG E1,LUO Ling-hui3,XIAO Hong-jun3,GONG Shu-sheng4.1.Department of Otorhinolaryngology,Wuhan No.1 Hospital,Integrative Medicine Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China;2.Department of Otorhinolaryngology, Wuxi Third People’s Hospital,Wuxi 214041,China;3.Department of Otorhinolaryngology,Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China;4.Department of Otorhinolaryngology,Beijing Friendship Hospital,Capital University of Medical Science,Beijing 100050, China.

Objective:To determine the differentially expressed genes of facial nucleus at the late stage of peripheral injury.Methods:The model was set up by facial-facial anastomosis in left facial nerve of rats.Contralateral side was selected as control.At the 90 day post-surgery,the rats were killed.The total RNA of facial nuclei at both sides were extracted;cDNA were obtained from purified total RNA by reversed-transcription.Biotinlabeled cRNA was synthesized by transcription and then was fragmented and hybridized with gene expression profile chip.The gene chip was scanned with scanner.Differentially expressed genes were statistically analyzed for biological function by gene ontology(GO)classes and KEGG pathway.Results:The detection of gene chip showed that 1660 genes were in the facial nucleus of the injury side and 1683 genes were in the healthy side. Three hundreds genes in facial nucleus at injury side,including 157 upregulated genes(difference times≥2)and 143 downregulated genes(difference times≤-2),were shown in differentially expressed profiles as compared to the controls.The differentially expressed genes were classified into functional categories such as cytokines,immune response molecules,signal transduction molecules,ion deliver and cell adhesion molecules,etc by GO analysis.KEGG Pathway analysis screened 32 relevant signal pathways,including leukocyte transmembrane transport pathway and focal adhesion kinase(FAK)pathway(P＜0.05).Conclusion:Multiple genes and complicated signal pathways are involved in the plastic activity of facial nucleus at late stage of peripheral injury and regeneration.

R741;R745.1+2

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.002

1.武漢市第一醫(yī)院（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院）耳鼻咽喉頭頸外科武漢 430022

2.無錫市第三人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科江蘇 無錫 214008 3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科武漢 430022

4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科北京 100050

國家自然科學(xué)基金（No.30600699, 30471879）

2015-11-07

陳沛chenpeioto@163. com