楊　瀾，南麗紅，何一博，郭　斌，李　煌，黃　枚（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

不同時間點的氧糖剝奪對器官型海馬腦片的影響

楊瀾，南麗紅，何一博，郭斌，李煌，黃枚
（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

目的觀察不同時長的氧糖剝奪對SD乳鼠器官型海馬腦片的影響，探討制備氧糖剝奪（OGD）模型的最佳時長。方法對海馬腦片進行碘化丙啶染色，用微量酶標法檢測培養(yǎng)液上清中LDH的釋放量。結(jié)果培養(yǎng)13 d后的腦片逐漸變薄，海馬結(jié)構(gòu)逐漸清晰，生長情況逐漸穩(wěn)定，無特異性熒光信號，LDH釋放各組無明顯差異性；與造模前24 h相比，隨著缺氧缺糖時間的增加，海馬腦片碘化丙啶染色的熒光信號強度與LDH釋放量增加，以45、60 m in時長最為明顯（P＜0.05或P＜0.01），但氧糖剝奪60 m in腦片的損傷更為嚴重，表現(xiàn)出無法恢復的趨勢。結(jié)論制備SD乳鼠海馬腦片氧糖剝奪模型的最佳時長為45min。

海馬腦片；氧糖剝奪；碘化丙啶；乳酸脫氫酶；OGD時間點

腦卒中是一種急性腦血管疾病，因其發(fā)病突然、治療時間窗狹窄的特點，導致病后致殘率高［1］。器官型腦片培養(yǎng)是一種新興的腦組織體外培養(yǎng)技術(shù)，兼?zhèn)湓隗w實驗的部分特點和離體實驗的優(yōu)點，正成為腦卒中后康復研究的常用模型［2］。海馬對缺血缺氧較為敏感［3］，因此，器官型海馬腦片被廣泛應用于缺血缺氧損傷相關機制的研究。我們擬在建立器官型海馬腦片制備和培養(yǎng)方法的基礎上，探討不同時長的氧糖剝奪（Oxygen-Glucose Deprivation，OGD）對器官型海馬腦片的影響，為進一步研究藥物對腦卒中后的康復治療作用提供實驗依據(jù)［4-6］。

1　實驗材料

1.1動物清潔級P7-9 SD乳鼠由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（閩）2012-0001。

1.2試劑MEM培養(yǎng)基 （美國Hyclone公司）；Hank's平衡鹽溶液（美國Hyclone公司）；細胞培養(yǎng)用青鏈霉素（美國Hyclone公司，批號：J130071）；馬血清 （美國Gibco公司，批號：1296647）；D-（+）-Glucose（美國 Sigma公司，批號：071M01452V）；Hepes（美國Sigma公司，批號：SLBK4575V）；碘化丙啶（美國Sigma公司，批號：MKBP1360V）；乳酸脫氫酶試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號：20140929）。

1.3實驗儀器Millicell-CM插入式細胞培養(yǎng)皿（美國Millipore公司）；5 000mz型振動切片機（英國Campden Instruments公司）；Forma 371型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；Galaxy CO170R型三氣培養(yǎng)箱 （美國NBS公司）；DM IL LED型倒置相差顯微鏡 （德國Leica公司）；EVOSFL型倒置熒光顯微鏡 （美國AMG公司）；SZ760型體視顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）。

2　實驗方法

2.1腦片制備及培養(yǎng)制備方法參考Stoppini方法［7］加以改進。P7-9乳鼠以75%乙醇浸泡消毒后，斷頭取腦，置于預冷的解剖液中，切除小腦、腦干部分，將大腦部分沿矢狀面對半切開，將裸露的腦半球冠狀平面粘附固定于振動切片機載物臺上。用振動切片機沿冠狀平面切下400μm的腦片若干，轉(zhuǎn)移至盛有預冷解剖液的培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下分離出海馬組織，轉(zhuǎn)移至Millicell-CM微孔膜上，每個微孔膜插件放置6個海馬腦片，將插件置于6孔培養(yǎng)板中，從孔邊緣加入1mL培養(yǎng)液。培養(yǎng)液成分：25%HBSS＋50%MEM＋25%Horse＋6.5 g/L DGlucose＋25 mM HEPES，pH 7.2～7.4，培養(yǎng)液含雙抗100 U/mL。將6孔培養(yǎng)板置于95%O2、5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后更換培養(yǎng)液，之后每3天更換1次培養(yǎng)液。

2.2腦片生長形態(tài)觀察腦片培養(yǎng)期間，使用倒置相差顯微鏡對腦片生長形態(tài)進行動態(tài)觀察，并于培養(yǎng)至第1、5、9、13天時拍照。

2.3分組及OGD損傷模型的建立培養(yǎng)14 d的海馬腦片，分為空白對照組、OGD 15 min組、OGD 30 min組、OGD 45 min組、OGD 60 min組，每組3孔，每孔3片腦片。OGD各組腦片用PBS漂洗3遍，每孔加入1 m L PBS，移入94%N2、5%CO2、1%O2、37℃的三氣培養(yǎng)箱孵育15、30、45、60 min后，吸棄無糖培養(yǎng)液PBS，更換為正常培養(yǎng)液1 mL，重新移入95%O2、5%CO237℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。空白對照組不作任何處理。

2.4PI染色于造模前24 h、造模后1、3、5 d進行PI染色。具體方法：每孔加入含50μg/mL PI染液的培養(yǎng)液1 mL，于95%O2、5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況。

2.5LDH檢測于造模前24 h、造模后1、3、5 d吸取海馬腦片培養(yǎng)液，離心取上清，根據(jù)試劑盒說明書，用微量酶標法測定腦片培養(yǎng)液上清中的LDH含量。

3　結(jié)果

3.1腦片生長形態(tài)培養(yǎng)1 d的腦片厚度迅速增加，隨著培養(yǎng)時間的增加，腦片逐漸變薄，由邊緣向中心逐漸變得透亮，組織邊緣界線逐漸模糊，觀察到有細胞向周圍浸潤生長，海馬結(jié)構(gòu)逐漸變得清晰可見，培養(yǎng)至13 d腦片生長情況逐漸穩(wěn)定，見圖1。

3.2PI染色情況PI染色結(jié)果顯示，空白對照組海馬腦片各時間點均無特異性熒光信號；OGD 15 min組缺氧缺糖1 d后僅可見極微弱熒光信號，3 d后熒光信號消失；OGD 30 min組缺氧缺糖1 d后出現(xiàn)弱熒光信號，3 d熒光信號有所增強，之后熒光信號逐漸減弱，提示腦組織可能在輕微損傷后啟動自我修復機制完成自我修復；OGD 45 min組缺氧缺糖1 d后出現(xiàn)強熒光信號，3 d熒光信號明顯增強，之后熒光強度維持在相對穩(wěn)定水平；OGD 60 min組缺氧缺糖后出現(xiàn)極強熒光信號，海馬區(qū)域全部紅染，3 d后熒光信號強度未見明顯減弱。

3.3培養(yǎng)液LDH含量檢測各組海馬腦片缺氧缺糖前培養(yǎng)液LDH釋放量無明顯差異（P＞0.05），缺氧缺糖后1 d，OGD 15 min、30 min組的LDH釋放量雖較空白對照組有所增高，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；OGD 45 min組、60 min組的LDH釋放量明顯高于空白對照組（P＜0.05或P＜0.01）。在缺氧缺糖后3、5 d各組的LDH釋放量較1 d有所減少，與空白對照組相比，OGD 15 min、30 min組的LDH釋放量無顯著性差異 （P＞0.05）；OGD 45 min組、60 min組的LDH釋放量明顯高于空白對照組（P＜0.05或P＜0.01），見表1、圖2。

表1　不同OGD時長對LDH釋放量的影響

4　討論

4.1對腦片施加OGD處理，可以模擬腦卒中后腦組織周圍缺氧缺糖的微環(huán)境。海馬是與哺乳動物學習和記憶相關的關鍵結(jié)構(gòu)，對缺血損傷較為敏感，因此海馬腦片尤其適用于缺血性腦損傷的研究［8］。

4.2本實驗通過對腦片生長狀態(tài)的動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1 d腦片厚度迅速增加，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，小膠質(zhì)細胞大量生成，倒置相差顯微鏡下透光性變差。隨著培養(yǎng)時間的增長，腦片逐漸變薄，透光性漸佳，由邊緣向中心逐漸變得透亮，組織邊緣界線逐漸模糊，小膠質(zhì)細胞數(shù)量逐漸減少，海馬結(jié)構(gòu)逐漸變得清晰可見，可見清晰的CA1、CA3區(qū)域及齒狀回結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)13 d腦片生長情況逐漸穩(wěn)定，可用于后續(xù)OGD實驗。國內(nèi)外報道的OGD誘導的海馬腦片缺氧缺糖損傷模型主要有浸沒法、充N2法及三氣培養(yǎng)箱缺氧法等，造模時長的選擇更是不盡相同。本課題組在腦片培養(yǎng)技術(shù)成熟的基礎上對造模時長進行相關探索，實驗采用PI染色熒光和LDH累積釋放量作為觀察和檢測指標，以評價不同造模時長對OGD誘導的海馬腦片缺氧缺糖損傷模型的影響。PI是一種細胞核染色試劑，其無法穿過完整的細胞膜，但可穿過凋亡或壞死細胞的破損細胞膜與DNA雙鏈結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光［9］。LDH廣泛存在于機體的細胞中，其滲出是細胞受損的標志，檢測LDH的累積釋放量可反應腦片的存活狀態(tài)［10］。研究表明，腦片的PI熒光信號強度和LDH釋放量具有相關性［11］。

本實驗PI熒光染色結(jié)果顯示，造模前各組均無紅色熒光信號，造模后1 d除OGD 15 min組外，其它組均出現(xiàn)強度不一的熒光信號，且隨著造模時間的增長，熒光強度逐漸增強，說明缺氧缺糖已造成腦片的損傷。造模后3 d，除OGD 15 min組外，其它組熒光信號均有所增強，推測此現(xiàn)象為遲發(fā)性的細胞凋亡或壞死，可能由于海馬腦片無法準確地復制在體腦缺血的神經(jīng)死亡的時間模式，因此于缺氧缺糖后2～4 d在CA1區(qū)出現(xiàn)了損傷的加劇。造模后 5 d，OGD 30 min組的熒光信號趨于消失，OGD 45 min組熒光信號稍有減弱，但仍較為穩(wěn)定，而OGD 60 min組紅色熒光發(fā)散，背景紅染，提示損傷進一步加劇。LDH釋放量檢測結(jié)果顯示，造模前各組LDH累積釋放量無顯著差異，造模后1 d各OGD組LDH釋放量均有不同程度的增加，且與造模時間的延長呈正相關，其中OGD 45 min組、OGD 60 min組LDH釋放量明顯高于空白組。此后各組仍維持相應趨勢，且能持續(xù)一定時間。

4.3實驗結(jié)果表明，在本實驗條件下，缺氧缺糖15、30 min不是制備OGD海馬腦片模型的最佳時長，最佳時長應為45 min以上。在本實驗中我們還觀察到缺氧缺糖60 min的海馬腦片損傷程度較缺氧缺糖45 min的損傷更為嚴重，表現(xiàn)出無法恢復的趨勢。所以，我們認為器官型海馬腦片的OGD誘導時長以45 min為宜，此模型可用于后續(xù)的腦卒中康復治療藥物的篩選及作用機制研究。

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R285.5

A

1000-338X（2016）01-0033-03

2015-10-21

福建省衛(wèi)生和計劃生育委員會資助課題（WZZY201302），福建中醫(yī)藥大學校管課題（X2014143、X2014127），國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510393019）

楊瀾（1990—），男，2013級藥理學專業(yè)碩士研究生，主要從事中藥神經(jīng)藥理研究。

黃枚（1966—），女，教授。E-mail：hmei0303@qq.com