金羊平 吳皓 郁紅禮 潘耀宗 陳葉青 王奎龍 張程超 王衛(wèi)

[摘要]為探索姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性的機(jī)制，該研究采用掌葉半夏毒針晶誘導(dǎo)的小鼠腹腔炎癥模型，觀察姜辣素對(duì)小鼠腹腔炎癥滲出液中炎癥介質(zhì)PGE2的影響；采用大鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，以上清液中TNFα和IL1β為指標(biāo)，研究姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶的致炎作用；采用掃描電鏡法觀察姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激后巨噬細(xì)胞表面形態(tài)的改變；采用巨噬細(xì)胞中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)模型，考察姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對(duì)中性粒細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示，姜辣素可以顯著抑制掌葉半夏毒針晶所致的小鼠腹腔滲出液中PGE2的生成；姜辣素可以顯著抑制掌葉半夏毒針晶誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，并具有一定的量效關(guān)系；掃描電鏡顯示，姜辣素可以顯著抑制巨噬細(xì)胞吞噬掌葉半夏毒針晶及細(xì)胞膜破損，并能顯著抑制掌葉半夏毒針晶誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞遷移。姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性的機(jī)制可能是抑制了包括巨噬細(xì)胞激活、炎癥因子釋放、中性粒細(xì)胞遷移聚集的致炎毒性。

[關(guān)鍵詞]姜辣素； 掌葉半夏； 巨噬細(xì)胞； 炎癥因子； 掃描電鏡； 中性粒細(xì)胞趨化

掌葉半夏，又名虎掌南星，為天南星科植物掌葉半夏Pinellia pedatisecta Schott的干燥塊莖，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，為天南星科有毒中藥且毒性最強(qiáng)，對(duì)口腔、咽喉等具有強(qiáng)烈的刺激性[2]。

本課題組前期研究證實(shí)，掌葉半夏刺激性毒性成分主要是蛋白和草酸鈣結(jié)合形成的針晶復(fù)合物，被稱為“毒針晶”[3]，電鏡下毒針晶極細(xì)長(zhǎng)、兩頭尖銳、質(zhì)堅(jiān)韌，具倒刺、凹槽[4]。毒理研究顯示，掌葉半夏的毒針晶在機(jī)體表現(xiàn)為刺激性炎性反應(yīng)。誤食后在口腔咀嚼或吞咽的作用力下，大量毒針晶可刺入口腔及咽喉的黏膜組織，毒針晶刺入的同時(shí)針晶上的毒蛋白進(jìn)入組織細(xì)胞誘發(fā)急性炎癥，故掌葉半夏的刺激性毒性是毒針晶刺入的機(jī)械刺激和毒蛋白化學(xué)刺激的雙重作用[56]。

生姜是姜科植物姜Zingiber officinale Rosc的根莖。生姜味辛，性溫；歸肺、胃、脾經(jīng)；功效為發(fā)散風(fēng)寒、溫中止嘔、化痰解毒，民間多用于解藥物和食物中毒。生姜及生姜提取物具有廣泛的藥理作用，包括調(diào)節(jié)免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、止嘔等藥理作用。生姜的塊莖中含有多種化學(xué)成分，主要包括揮發(fā)油類、姜辣素、二苯基庚烷，其中姜辣素類成分是生姜抗炎的有效成分[7]。

課題組前期研究顯示，掌葉半夏刺激性毒性與其刺激巨噬細(xì)胞相關(guān)[810]。炎癥反應(yīng)最重要的功能是將炎癥細(xì)胞輸送到炎癥局部，白細(xì)胞的滲出是炎癥反應(yīng)最重要的特征，所以中性粒細(xì)胞遷移是炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要的一步，起到主要的防御作用。故本文采用腹腔注射掌葉半夏毒針晶致小鼠腹腔炎癥模型、大鼠腹腔巨噬細(xì)胞（MΦ）體外培養(yǎng)模型及體外中性粒細(xì)胞共遷移模型，深入研究姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對(duì)巨噬細(xì)胞的致炎作用，為深入闡釋生姜解掌葉半夏及整個(gè)天南星科有毒中藥的毒性作用機(jī)制提供依據(jù)。

1材料

BP211D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；LDZ2（Y）低速離心機(jī)（北京京立有限公司）；Spectra Max 190酶標(biāo)儀（美國(guó)AD公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)NUAIRE公司）；LEICA MPS 60 DM顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)萊卡公司）； IB5離子濺射儀（日本日立公司）； SEM505掃描電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司）。

胎牛血清（美國(guó)WISENT 公司）；RPMI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；trasnwell小室，48孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；DextranT500（葡聚糖）（美國(guó)Pharmacia公司），Percoll分離液；快速瑞姬氏染液（南京建成生物工程研究所）；TNFα，IL1β ELISA試劑盒（美國(guó)Ebioscience公司）；Mouse PGE2 ELISA試劑盒（南京翼飛雪生物科技有限公司）；臺(tái)盼藍(lán)（南京化學(xué)試劑有限公司）；非特異性酯酶染液（南京建成生物有限公司）；戊二醛（電鏡級(jí)，美國(guó)Alfa公司）；乙醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；生理鹽水（南京小營(yíng)藥業(yè)集團(tuán)）；PBS緩沖液（實(shí)驗(yàn)室自制，高壓蒸氣滅菌）；羧甲基纖維素鈉（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），相關(guān)溶液均使用去離子水配制。

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體重200～220 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（浙）20140001；ICR小鼠，清潔級(jí)，雄性，體重20～22 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號(hào)SCXK（蘇）20120004。

掌葉半夏采自河南省禹州市，藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)王春根教授鑒定為天南星科植物掌葉半夏Ppedatisecta的塊莖。生姜藥材購(gòu)自南京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為姜科植物姜的新鮮根莖。

2方法

21樣品制備

211掌葉半夏毒針晶的分離純化取鮮掌葉半夏適量，去皮切碎，置于研缽內(nèi)，加入適量的有機(jī)溶劑，進(jìn)行研磨，重復(fù)2～3次，將研磨提取的混懸液合并，先用4層醫(yī)用紗布過濾，濾液再經(jīng)過022 μm微孔濾膜抽濾，得到的白色濾餅即為掌葉半夏毒針晶[11]。

212生姜姜辣素的制備取鮮生姜適量，切碎，低溫烘干，打成粗粉，用10倍量乙酸乙酯加熱回流2 h，重復(fù)2次，回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏；水蒸氣提取除去揮發(fā)油，得到姜辣素部位[12]，得率為09%。

以6姜酚為對(duì)照品，采用紫外分光光度法對(duì)生姜姜辣素部位中總姜辣素含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，生姜姜辣素部位中總姜辣素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8928%。

22姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性作用研究

221姜辣素對(duì)掌葉半夏毒針晶致小鼠腹腔炎癥滲出液中PGE2含量的影響取小鼠60只，隨機(jī)分為6組，空白組、毒針晶組、阿司匹林組（25 g·kg-1）、姜辣素高劑量組（8 g·kg-1）、姜辣素中劑量組（4 g·kg-1）、姜辣素低劑量組（2 g·kg-1）。實(shí)驗(yàn)前1 d晚上禁食不禁水，實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠腹腔注射1 g·L-1掌葉半夏毒針晶生理鹽水混懸液，空白組腹腔注射生理鹽水001 mL·g-1。各組立即灌胃給予相應(yīng)藥物，姜辣素高、中、低劑量組分別灌以8，4，2 g·kg-1姜辣素05% CMCNa混懸液，空白組和毒針晶組均灌以05% CMCNa溶液，阿司匹林組灌以025 g·kg-1阿司匹林05% CMCNa混懸液，002 mL·g-1。1 h后處死，立即向每只小鼠腹腔注射生理鹽水10 mL，輕揉腹部使之混勻。在5 min內(nèi)取出小鼠腹腔內(nèi)全部溶液置刻度離心管中，得到小鼠腹腔滲出液。取滲出液，按ELISA試劑盒方法測(cè)定前列腺素E2（PGE2）的含量[8]。

222巨噬細(xì)胞的提取分離純化將健康大鼠脫頸椎處死，加入75%乙醇浸泡3 min后取出，腹腔注射20 mL PBS緩沖液，輕揉腹部5 min，使PBS緩沖液散布于整個(gè)腹腔，收集腹腔液，1 000 r·min-1離心5 min，得到富含巨噬細(xì)胞的沉淀。棄去上清，沉淀用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，將此密度的細(xì)胞接種于細(xì)胞板中，37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)2 h后，用PBS緩沖液洗去未貼壁的細(xì)胞，未被洗去的貼壁細(xì)胞即為所需的巨噬細(xì)胞，非特異性酯酶染色鑒定巨噬細(xì)胞純度為99%；臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞存活率為99%[9]。

223人外周血中性粒細(xì)胞的分離純化無(wú)菌采集健康志愿者的外周靜脈血，加EDTAK2抗凝，取5 mL，加等量生理鹽水稀釋，再加1/3體積的6% T500，混合后靜置30 min，吸取上清于1 500 r·min-1離心10 min， 棄去上清液，沉淀用1 mL RPMI 1640培養(yǎng)液重懸。100%的Percoll細(xì)胞分離液用無(wú)菌生理鹽水分別配成75%，60% 2種不同密度的分離液，在離心管中依次加入75% Percoll，60% Percoll和細(xì)胞懸液，于2 500 r·min-1離心20 min，收集2層分離液中間的細(xì)胞層，并用PBS緩沖液清洗2遍，即得到純化的中性粒細(xì)胞[9]。

224姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子取222項(xiàng)下分離純化的巨噬細(xì)胞用PBS緩沖液清洗數(shù)次，并加入新鮮配制的含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。取適量掌葉半夏毒針晶于紫外燈下充分照射滅菌，用 PBS緩沖液配成針晶混懸液。將培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分成7組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，其中6組給予半夏毒針晶混懸液，使終濃度為50 mg·L-1；空白組給予相同體積的PBS緩沖液，搖晃均勻后于37 ℃，5% CO2環(huán)境中孵育，10 min后其中2組給予阿司匹林溶液，使終濃度為25，50 mg·L-1；另外3組分別給予對(duì)應(yīng)濃度的姜辣素溶液， 使終濃度為25，50，100 mg·L-1。孵育1 h后收集細(xì)胞上清液，上清液中炎癥因子TNFα和IL1β的水平按照ELISA試劑盒說(shuō)明書的方法分別進(jìn)行檢測(cè)[9]。

225姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響大鼠腹腔巨噬細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于內(nèi)置無(wú)菌蓋破片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)成血清饑餓狀態(tài)。掌葉半夏毒針晶經(jīng)紫外照射充分滅菌后，用PBS緩沖液配制成針晶混懸液。培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分為5組，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。其中4組加入等體積的掌葉半夏毒針晶混懸液，使終濃度保持為50 mg·L-1，其中3組分別同時(shí)加入不同質(zhì)量濃度的姜辣素溶液（25，50，100 mg·L-1）；空白組加入等體積的PBS緩沖液，放置于37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)1 h后中止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗，最后用25%戊二醛4 ℃固定過夜。載有固定好的巨噬細(xì)胞的蓋玻片用30%，50%，70%，80%，90%，100%乙醇逐級(jí)脫水，噴金，并在掃描電鏡下以6 000倍放大觀察巨噬細(xì)胞的形態(tài)，并拍攝照片[9]。

226姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細(xì)胞引起的中性粒細(xì)胞遷移本實(shí)驗(yàn)采用transwell小室模型，上室中加入RPMI 1640混勻的中性粒細(xì)胞懸液100 μL，密度為1×106個(gè)/mL，下室中分別為：①預(yù)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞+PBS緩沖液；②預(yù)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞+PBS緩沖液配制的掌葉半夏毒針晶混懸液，使其終濃度為50 mg·L-1；③預(yù)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞+掌葉半夏毒針晶混懸液（50 mg·L-1）+姜辣素溶液（25，50，100 mg·L-1）。

每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)1 h后，將小室取出，用棉簽將小室上表面的殘留細(xì)胞除去，并用快速瑞姬氏染色試劑盒對(duì)小室下表面細(xì)胞進(jìn)行染色，于顯微鏡400倍鏡下觀察，并對(duì)穿過微孔膜的著色中性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)[13]。

3結(jié)果

31姜辣素對(duì)掌葉半夏毒針晶致小鼠腹腔炎癥滲出液中PGE2含量的影響

毒針晶組與空白組比較有顯著性差異（P<00l），說(shuō)明掌葉半夏毒針晶能造成小鼠腹腔炎癥液中PGE2含量顯著增高；而姜辣素組能顯著地抑制掌葉半夏毒針晶所致的小鼠腹腔炎癥滲出液中PGE2合成與釋放，并呈一定的劑量依賴性（圖1）。

與空白組比較1）P<001；與毒針晶組比較2）P<001（圖2，4同）。

32姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對(duì)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子的影響

姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，與掌葉半夏毒針晶模型組相比，不同質(zhì)量濃度的姜辣素（25，50，100 mg·L-1）均能顯著抑制巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子TNFα和IL1β的水平，并且這種抑制作用呈一定的量效相關(guān)（圖2）。

33姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

與半夏毒針晶組相比，加入不同質(zhì)量濃度的姜辣素（25，50，100 mg·L-1），可以不同程度的抑制巨噬細(xì)胞的皺縮、偽足增多、細(xì)胞膜破損，并且高濃度的姜辣素組可以使活化的巨噬細(xì)胞恢復(fù)至正常狀態(tài)（圖3）。結(jié)果表明，姜辣素能夠抑制掌葉半夏毒針晶激活巨噬細(xì)胞吞噬異物的功能。

34姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞趨化的影響

與毒針晶模型組相比，加入姜辣素（25，50，100 mg·L-1）組中性粒細(xì)胞遷移數(shù)量顯著降低，這表明姜辣素抑制了掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細(xì)胞引起的中性粒細(xì)胞遷移，并呈一定的劑量依賴性，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了姜辣素可以顯著抑制掌葉半夏毒針晶的致炎作用（圖4）。

4討論

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜辣素灌胃給藥能明顯減輕掌葉半夏毒針晶所致的炎癥反應(yīng)，口服姜辣素能顯著降低毒針晶所致小鼠腹腔炎癥介質(zhì)PGE2的生成，且這種拮抗作用呈劑量依賴性，說(shuō)明生姜確實(shí)可以降低因服用掌葉半夏而導(dǎo)致的一些毒副作用。實(shí)驗(yàn)將阿司匹林作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果阿司匹林也能明

顯降低掌葉半夏毒針晶所致的炎癥反應(yīng)，表明阿司

匹林作為解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥具有確切的抗炎作用，也可進(jìn)一步說(shuō)明掌葉半夏毒針晶確實(shí)能導(dǎo)致刺激性炎癥反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)中各模型掌葉半夏毒針晶致炎劑量的確定，采用掌葉半夏毒針晶的量毒曲線和時(shí)毒曲線進(jìn)行考察，結(jié)果小鼠腹膜炎模型選擇01%掌葉半夏毒針晶劑量；參考中醫(yī)臨床生姜解半夏中毒的用量30 g，相當(dāng)于小鼠灌胃劑量4 g·kg-1。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，此劑量對(duì)掌葉半夏毒針晶引起的炎癥反應(yīng)均具有較好的抑制作用，能減少炎癥介質(zhì)的合成與釋放，降低炎癥組織水腫。

本文選擇大鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)、巨噬細(xì)胞中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)2個(gè)模型，根據(jù)課題組前期研究結(jié)果選擇掌葉半夏毒針晶50 mg·L-1作為致炎濃度，研究姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶的刺激性毒性機(jī)制。結(jié)果顯示，姜辣素能夠顯著拮抗掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子；掃描電鏡顯示，姜辣素可以顯著抑制巨噬細(xì)胞激活、偽足增多，細(xì)胞變形、細(xì)胞膜破損，說(shuō)明姜辣素可以抑制巨噬細(xì)胞吞噬異物的功能；巨噬細(xì)胞中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，姜辣素能夠抑制掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細(xì)胞引起的中性粒細(xì)胞趨化，并呈一定的劑量依賴性。故姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性的機(jī)制可能是抑制了包括巨噬細(xì)胞激活、吞噬異物、炎癥因子

釋放、中性粒細(xì)胞遷移聚集，最終抑制了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

天南星科有毒中藥半夏、掌葉半夏、天南星、白附子均含有毒針晶，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，以上 4 種中藥毒針晶是其共性毒性成分。本文從細(xì)胞分子水平上初步闡釋了生姜解掌葉半夏毒的作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示天南星科有毒中藥的炮制解毒機(jī)制及安全性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯馬超一]