吳先闖 郝海軍 劉瑜新 宋曉勇 張永州 張紅芹

[摘要]為了提高羥喜樹堿的生物利用度，該研究制備了羥喜樹堿固體分散體和羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體，并評價其溶解度、溶出度。SD大鼠分別灌胃給予羥喜樹堿固體分散體和羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體，取血，以喜樹堿為內(nèi)標，HPLC測定羥喜樹堿的血藥濃度，并計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明羥喜樹堿2種固體分散體的Cmax，AUC0t及AUC0∞與原料藥相比都有顯著性提高。羥喜樹堿固體分散體的AUC0t與原料藥的AUC0t相比提高17687%；而羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體提高27259%。因此，羥喜樹堿2種固體分散體可顯著性提高羥喜樹堿的口服吸收生物利用度，但羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體效果更優(yōu)。

[關(guān)鍵詞]羥喜樹堿；固體分散體；生物利用度

羥基喜樹堿（10hydroxycamptothecin， HCPT）是我國特有珙垌科喬木喜樹種子中分離提取的一種生物堿，是目前從喜樹中分離出20多個單體中抗癌作用最強的化合物。與抗代謝藥及烷化劑不同，HCPT可選擇性地抑制拓樸異構(gòu)酶I（topoismerase I， Topo I），從而干擾DNA的復(fù)制。且與其他常用的抗腫瘤藥無交叉耐藥，因此在抗腫瘤方面具有很好的應(yīng)用前景[1]。但HCPT水溶性、脂溶性均較差，大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。目前臨床上使用的注射劑采用與氫氧化鈉反應(yīng)成鹽使之溶解，但其E環(huán)被打開，活性下降。同時注射可能帶來感染，血栓形成及藥物外滲造成組織壞死等不良反應(yīng)。目前HCPT研究較多的有納米粒、脂質(zhì)納米粒、納米微球、納米脂質(zhì)體、膠束等注射劑型[14]。對于羥喜樹堿需要長期使用的化療藥物，開發(fā)口服給藥制劑顯得意義重大。

固體分散體（solid dispersion， SD）的基本原理是利用水溶性載體將難溶性藥物制成固體分散體，以增加難溶性藥物的溶解度。該技術(shù)可使難溶性藥物具有高度分散性并具有高度潤濕性，加速藥物的溶出，提高吸收速度，從而提高難溶性藥物的口服吸收生物利用度。磷脂復(fù)合物（phospholipid comple or phytosomes ）系指在非質(zhì)子傳遞體系溶劑中，藥物與磷脂以一定配比關(guān)系結(jié)合而形成的復(fù)合物[510]。形成磷脂復(fù)合物后， 藥物的脂溶性與水溶性均可得到明顯改善，其親脂性的改善更為顯著[7]。但磷脂復(fù)合物疏水性較強，導(dǎo)致其分散性較差。進一步將磷脂復(fù)合物制備成固體分散體可改善磷脂復(fù)合物的分散性，提高溶出速率，有利于進一步提高藥物的生物利用度。本文分別制備了羥喜樹堿固體分散體（HCPTSD）及羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體（HCPTPCSD），并對其理化性質(zhì)進行了初步研究，進而比較2種固體分散體在體內(nèi)的藥動學(xué)及吸收生物利用度，以期為相關(guān)研究提供有價值的參考。

1材料

LC10A型高效液相色譜儀；SPD10A型紫外可見檢測器（日本島津公司）；MD2002型氮氣吹掃儀（杭州奧威儀器有限公司）；RE52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；BS224S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；THZ92A型恒溫振蕩器（翠柳實驗儀器公司）；XW80A型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；M307098型控溫式磁力攪拌器（上海至威電器有限公司）；DZF6050型真空干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

10羥基喜樹堿（湖北康寶泰精細化工有限公司，純度>995%）；大豆卵磷脂（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）；聚乙烯吡絡(luò)烷酮（PVP K30，中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；肝素（南京新百藥業(yè)有限公司）；其余均為分析純或藥用規(guī)格。

SD大鼠，雌雄兼用，體重（300±20） g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）20030003。

2方法

21羥喜樹堿固體分散體的制備[11]

采用溶劑熔融法制備固體分散體。按質(zhì)量比1∶15將載體PVP K30在60 ℃下熔融，取羥喜樹堿溶解于丙酮中。將羥喜樹堿有機溶液加入到熔融狀態(tài)載體中，攪拌均勻。于60 ℃水浴上繼續(xù)攪拌除去有機溶劑，殘留物置于45 ℃真空干燥24 h，即得羥喜樹堿固體分散體。于干燥器中保存，備用。

22羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體的制備[12]

采用溶劑法制備羥喜樹堿磷脂復(fù)合物[3]。按摩爾比1∶1將羥喜樹堿與磷脂溶解度丙酮中，50 ℃攪拌6 h，減壓蒸干，回收有機溶劑。置于45 ℃真空干燥24 h，即得羥喜樹堿磷脂復(fù)合物。按質(zhì)量比1∶15將羥喜樹堿磷脂復(fù)合物與PVP K30溶解于無水乙醇中，于50 ℃攪拌2 h后減壓蒸干，回收乙醇。置于45 ℃真空干燥24 h，即得羥喜樹堿固體分散體。于干燥器中保存，備用。

23X射線衍射（XRD）分析

HCPT在2種固體分散體中的分散狀態(tài)用XRD進行分析。掃描條件：銅靶，管壓40 kV，管流200 mA，掃描速度為5°/min，掃描范圍3～45°。

242種固體分散體溶解度考察

取過量的HCPT，HCPTSD及HCPTPCSD加入到蒸餾水中，25 ℃下按照恒溫搖床法平衡24 h。022 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液適當稀釋后，HPLC測定，并計算溶解度。

252種固體分散體體外溶出度考察

分別稱取20 mg羥喜樹堿，含等量羥喜樹堿固體分散體及羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體，分別置于透析袋中。以含10%SDS的醋酸緩沖液（pH=40）900 mL為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，溫度（37±05） ℃，分別于5，10，20，30，45，60，90 min取5 mL，并同時補同溫度、同體積的溶出介質(zhì)。樣品溶液經(jīng)045 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液，測定峰面積并繪制溶出曲線。

26HCPT測定方法的建立

261色譜條件C18色譜柱（46 mm×200 mm， 5 μm）；柱溫35 ℃；檢測波長為384 nm；流速為10 mL·min-1。對于血漿樣品，流動相為甲醇03%醋酸溶液（三乙胺調(diào)pH至40） 6∶4；對于其他樣品流動相為甲醇01 mol PBS（pH 40） 6∶4，其他條件不變。

262血漿樣品處理方法血漿樣品解凍后，渦旋混勻，精密吸取100 μL于離心管中，加入內(nèi)標200 μL，渦旋混勻，加入提取液（正己烷二氯甲烷異丙醇100∶50∶3）3 mL，6 000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上層有機相于另一離心管中，40 ℃液氮氣吹干，殘渣用100 μL 流動相復(fù)溶，取20 μL 進樣HPLC測定。

263對照溶液的配制精密稱取羥喜樹堿對照品496 mg，置于50 mL量瓶中，乙腈超聲溶解，定容至刻度線。分別量取01，02，05，10，20 mL置于25 mL量瓶中，用流動相定容至刻度線，得質(zhì)量濃度為0396 8，0793 6，1984，3968，7936 mg·L-1的對照品溶液。各濃度分別繼續(xù)取01 mL置于10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為3968，7936，1984，3968，7936 μg·L-1的系列對照溶液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

264內(nèi)標溶液的制備精密稱取喜樹堿30 mg，置于100 mL量瓶中，加入一定量的DMSO溶解后乙腈定容至刻度線，搖勻。精密量取10 mL內(nèi)標儲備液置于100 mL量瓶中，乙腈定容至刻度線即得03 mg·L-1的內(nèi)標溶液。

265標準曲線的制備于100 μL空白大鼠血漿中加入系列對照溶液，并分別加入內(nèi)標溶液50 μL，按照262項下進行處理，進樣測定。記錄羥喜樹堿峰面積（As）與內(nèi)標的峰面積（Ai），以As與Ai之比對質(zhì)量濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程C=20147As/Ai-092，r=0999 0；線性范圍3968～7936 μg·L-1。

266日內(nèi)及日間精密度分別配制低、中、高（3968，1984，7936 μg·L-1）3個質(zhì)量濃度的血漿樣品，按照262方法處理。各濃度在1 d內(nèi)連續(xù)測定5次，得日內(nèi)精密度。各濃度連續(xù)測定5 d，每天1次，得日間精密度。低、中、高濃度日內(nèi)精密度RSD分別為69%，51%，56%。低、中、高濃度日間精密度RSD分別為90%，67%，52%。

267回收率實驗分別配制低、中、高（3968，1984，7936 μg·L-1）3個質(zhì)量濃度的血漿樣品，按照262方法處理。進樣分析，計算測定值及回收率。結(jié)果顯示低、中、高3個質(zhì)量濃度平均回收率分別為9072%，9204%，9447%。

268血漿樣品穩(wěn)定性試驗將含藥血漿樣品置于-20 ℃冰箱保存，分別于0，5，10，20 d按照262項下處理，并進樣測定其濃度。結(jié)果顯示，濃度波動無統(tǒng)計學(xué)意義，表明血漿樣品在-20 ℃冰箱保存20 d內(nèi)穩(wěn)定。

27大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

271實驗方案取SD大鼠18只，隨機分為3組，每組6只，實驗之前12 h禁食不禁水。分別灌胃給予羥喜樹堿原料藥混懸液、羥喜樹堿固體分散體和羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體，給藥劑量以羥喜樹堿計為3 mg·kg-1。分別于0133，025，033，05，075，10，15，20，30，50，80 h眼眶取血06 mL，置于肝素化離心管中，3 000 r·min-1離心3 min，以262項下處理進樣測定血藥濃度，并繪制血藥濃度時間曲線。

272數(shù)據(jù)分析達峰時間（Tmax）和達峰濃度（Cmax）均采用實測值，藥時曲線下面積（AUC0～∞）采用梯形法計算，數(shù)據(jù)以±s的形式表示。

3結(jié)果

31X射線衍射（XRD）分析

結(jié)果見圖1。HCPT原料藥具有明顯的晶體衍射，表明HCPT主要以結(jié)晶型存在。HCPTSD和HCPTPCSD 2種固體分散體表現(xiàn)出典型的無定型結(jié)構(gòu)峰，HCPT的晶體衍射峰完全消失，說明HCPT以無定形態(tài)高度分散在2種固體分散體的載體材料中，使HCPT自身的晶體衍射峰被抑制，從而表現(xiàn)出無定型結(jié)構(gòu)峰，有利于HCPT溶解度的改善及溶出速率的增加。而物理混合物仍有HCPT的晶體衍射峰存在，表明成功制備了不同于物理混合物的HCPTSD和HCPTPCSD 2種固體分散體。

32表觀溶解度實驗

HCPT 2種固體分散體溶解度結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，HCPTSD和HCPTPCSD的表觀溶解度分別為（3021±057），（5723±033）mg·L-1，與HCPT表觀溶解度相比都得到極顯著性提高

（P<001）。另外，與HCPTSD表觀溶解度相比，HCPTPCSD的表觀溶解度有顯著性提高（P<005），表明將HCPT制備成HCPTPC，并進一步制備成固體分散體后能進一步增加HCPT的表觀溶解度。

33體外溶出實驗

HCPT 2種固體分散體體外溶出實驗結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，HCPT 2種固體分散體在50 min左右累積溶出度達到80%以上，而HCPT原料藥90 min內(nèi)累積溶出度僅為2192%。HCPTPCSD的累積溶出度高于HCPTSD，這可能與其表觀溶解度高于HCPTSD有關(guān)。

34HCPT 2種固體分散體體內(nèi)藥動學(xué)研究[12]

將ig給藥后的各組大鼠血漿按262項下方法處理，261項下色譜條件檢測HCPT的量，并繪

制血藥濃度時間曲線，結(jié)果見圖3，各主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。HCPT的2種固體分散體的Cmax，AUC0t，AUC0∞與原料藥相比都有顯著性提高。Cmax由（2741±455） μg·L-1分別顯著性提高到（4276±479），（6316±524） μg·L-1。HCPTSD的AUC0t與原料藥相比提高17687%；而HCPTPCSD提高27259%，12 h后仍可檢測到少量HCPT。而且HCPTPCSD的AUC0t或AUC0∞與HCPTSD相比具有顯著性差異（P<005）。另外，HCPTPCSD的Tmax與HCPT和HCPTSD的Tmax相比有顯著性延長。研究結(jié)果表明2種固體分散體的制備均有助于增加HCPT的吸收和進入體循環(huán)的量，從而提高口服生物利用；而HCPTPCSD與HCPTSD相比在增加HCPT口服吸收生物利用度方面更具優(yōu)勢。

4討論

HCPT溶解度較差，在水中僅為451 mg·L-1[3]。改善其溶解度及累積溶出度，可提高口服吸收生物利用度。固體分散體技術(shù)用于難溶性藥物提高藥物溶解度及溶出度、提高口服吸收生物利用已受到國內(nèi)外藥學(xué)工作者的普遍關(guān)注。本研究將HCPT分別制備成HCPTSD及HCPTPCSD后，XRD衍射實驗結(jié)果顯示，HCPT在2種固體分散體中以無定型狀態(tài)存在，有助于溶解度和累積溶出度的提高。溶解度實驗結(jié)果顯示，HCPTSD和HCPTPCSD的表觀溶解度分別為（3021±057），（5723±033） mg·L-1，與HCPT表觀溶解度相比都得到極顯著性提高（P<001）。體外溶出實驗結(jié)果表明，2種固體分散體在50 min內(nèi)累積溶出度達到80%以上，而HCPT原料藥90 min內(nèi)累積溶出度僅為2192%。HCPT溶解度及累積溶出度的改善為提高其口服吸收生物利用奠定了基礎(chǔ)。

SD大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，HCPT的2種固體分散體的Cmax，AUC0t，AUC0∞與原料藥相比都有顯著性提高。HCPTSD和HCPTPCSD的AUC0t與原料藥相比提高17687%，27259%。HCPTPCSD的Tmax與HCPT和HCPTSD的Tmax相比有顯著性延長，這可能是因為磷脂復(fù)合物增加了HCPT的脂溶性，經(jīng)胃腸道黏膜上皮細胞時因其較強的脂溶性而暫時滯留于其中，磷脂復(fù)合物中的藥物則持續(xù)緩慢釋放入血液循環(huán)[6]，因而HCPTPCSD的Tmax有顯著性延長。HCPTPCSD的AUC0t或AUC0∞與HCPTSD相比具有顯著性增加（P<005）。這可能是因為藥物有良好的水溶性，適度的脂溶性才能較好地經(jīng)黏膜吸收，HCPTSD只增加了HCPT的水溶性；而HCPTPCSD不僅增加了HCPT的脂溶性（磷脂復(fù)合物技術(shù)），同時也增加了水溶性（固體分散體技術(shù)）[12]，因而HCPTPCSD與HCPT SD相比更具有增加口服吸收生物利用度的優(yōu)勢。采用磷脂復(fù)合物與固體分散體聯(lián)用技術(shù)為改善一些中藥成分生物活性較強而體內(nèi)吸收較差較差，提高其口服吸收生物利用度提供了新的策略。

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[責(zé)任編輯曹陽陽]