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        羥喜樹堿2種固體分散體在SD大鼠口服吸收生物利用度的比較

        2016-05-11 16:46:09吳先闖郝海軍劉瑜新宋曉勇張永州張紅芹
        中國中藥雜志 2016年6期

        吳先闖 郝海軍 劉瑜新 宋曉勇 張永州 張紅芹

        [摘要]為了提高羥喜樹堿的生物利用度,該研究制備了羥喜樹堿固體分散體和羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體,并評價其溶解度、溶出度。SD大鼠分別灌胃給予羥喜樹堿固體分散體和羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體,取血,以喜樹堿為內(nèi)標,HPLC測定羥喜樹堿的血藥濃度,并計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明羥喜樹堿2種固體分散體的Cmax,AUC0t及AUC0∞與原料藥相比都有顯著性提高。羥喜樹堿固體分散體的AUC0t與原料藥的AUC0t相比提高17687%;而羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體提高27259%。因此,羥喜樹堿2種固體分散體可顯著性提高羥喜樹堿的口服吸收生物利用度,但羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體效果更優(yōu)。

        [關(guān)鍵詞]羥喜樹堿;固體分散體;生物利用度

        羥基喜樹堿(10hydroxycamptothecin, HCPT)是我國特有珙垌科喬木喜樹種子中分離提取的一種生物堿,是目前從喜樹中分離出20多個單體中抗癌作用最強的化合物。與抗代謝藥及烷化劑不同,HCPT可選擇性地抑制拓樸異構(gòu)酶I(topoismerase I, Topo I),從而干擾DNA的復(fù)制。且與其他常用的抗腫瘤藥無交叉耐藥,因此在抗腫瘤方面具有很好的應(yīng)用前景[1]。但HCPT水溶性、脂溶性均較差,大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。目前臨床上使用的注射劑采用與氫氧化鈉反應(yīng)成鹽使之溶解,但其E環(huán)被打開,活性下降。同時注射可能帶來感染,血栓形成及藥物外滲造成組織壞死等不良反應(yīng)。目前HCPT研究較多的有納米粒、脂質(zhì)納米粒、納米微球、納米脂質(zhì)體、膠束等注射劑型[14]。對于羥喜樹堿需要長期使用的化療藥物,開發(fā)口服給藥制劑顯得意義重大。

        固體分散體(solid dispersion, SD)的基本原理是利用水溶性載體將難溶性藥物制成固體分散體,以增加難溶性藥物的溶解度。該技術(shù)可使難溶性藥物具有高度分散性并具有高度潤濕性,加速藥物的溶出,提高吸收速度,從而提高難溶性藥物的口服吸收生物利用度。磷脂復(fù)合物(phospholipid comple or phytosomes )系指在非質(zhì)子傳遞體系溶劑中,藥物與磷脂以一定配比關(guān)系結(jié)合而形成的復(fù)合物[510]。形成磷脂復(fù)合物后, 藥物的脂溶性與水溶性均可得到明顯改善,其親脂性的改善更為顯著[7]。但磷脂復(fù)合物疏水性較強,導(dǎo)致其分散性較差。進一步將磷脂復(fù)合物制備成固體分散體可改善磷脂復(fù)合物的分散性,提高溶出速率,有利于進一步提高藥物的生物利用度。本文分別制備了羥喜樹堿固體分散體(HCPTSD)及羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體(HCPTPCSD),并對其理化性質(zhì)進行了初步研究,進而比較2種固體分散體在體內(nèi)的藥動學(xué)及吸收生物利用度,以期為相關(guān)研究提供有價值的參考。

        1材料

        LC10A型高效液相色譜儀;SPD10A型紫外可見檢測器(日本島津公司);MD2002型氮氣吹掃儀(杭州奧威儀器有限公司);RE52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);BS224S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);THZ92A型恒溫振蕩器(翠柳實驗儀器公司);XW80A型漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);M307098型控溫式磁力攪拌器(上海至威電器有限公司);DZF6050型真空干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)。

        10羥基喜樹堿(湖北康寶泰精細化工有限公司,純度>995%);大豆卵磷脂(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司);聚乙烯吡絡(luò)烷酮(PVP K30,中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司);肝素(南京新百藥業(yè)有限公司);其余均為分析純或藥用規(guī)格。

        SD大鼠,雌雄兼用,體重(300±20) g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)20030003。

        2方法

        21羥喜樹堿固體分散體的制備[11]

        采用溶劑熔融法制備固體分散體。按質(zhì)量比1∶15將載體PVP K30在60 ℃下熔融,取羥喜樹堿溶解于丙酮中。將羥喜樹堿有機溶液加入到熔融狀態(tài)載體中,攪拌均勻。于60 ℃水浴上繼續(xù)攪拌除去有機溶劑,殘留物置于45 ℃真空干燥24 h,即得羥喜樹堿固體分散體。于干燥器中保存,備用。

        22羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體的制備[12]

        采用溶劑法制備羥喜樹堿磷脂復(fù)合物[3]。按摩爾比1∶1將羥喜樹堿與磷脂溶解度丙酮中,50 ℃攪拌6 h,減壓蒸干,回收有機溶劑。置于45 ℃真空干燥24 h,即得羥喜樹堿磷脂復(fù)合物。按質(zhì)量比1∶15將羥喜樹堿磷脂復(fù)合物與PVP K30溶解于無水乙醇中,于50 ℃攪拌2 h后減壓蒸干,回收乙醇。置于45 ℃真空干燥24 h,即得羥喜樹堿固體分散體。于干燥器中保存,備用。

        23X射線衍射(XRD)分析

        HCPT在2種固體分散體中的分散狀態(tài)用XRD進行分析。掃描條件:銅靶,管壓40 kV,管流200 mA,掃描速度為5°/min,掃描范圍3~45°。

        242種固體分散體溶解度考察

        取過量的HCPT,HCPTSD及HCPTPCSD加入到蒸餾水中,25 ℃下按照恒溫搖床法平衡24 h。022 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液適當稀釋后,HPLC測定,并計算溶解度。

        252種固體分散體體外溶出度考察

        分別稱取20 mg羥喜樹堿,含等量羥喜樹堿固體分散體及羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體,分別置于透析袋中。以含10%SDS的醋酸緩沖液(pH=40)900 mL為釋放介質(zhì),轉(zhuǎn)速100 r·min-1,溫度(37±05) ℃,分別于5,10,20,30,45,60,90 min取5 mL,并同時補同溫度、同體積的溶出介質(zhì)。樣品溶液經(jīng)045 μm微孔濾膜過濾后,取續(xù)濾液,測定峰面積并繪制溶出曲線。

        26HCPT測定方法的建立

        261色譜條件C18色譜柱(46 mm×200 mm, 5 μm);柱溫35 ℃;檢測波長為384 nm;流速為10 mL·min-1。對于血漿樣品,流動相為甲醇03%醋酸溶液(三乙胺調(diào)pH至40) 6∶4;對于其他樣品流動相為甲醇01 mol PBS(pH 40) 6∶4,其他條件不變。

        262血漿樣品處理方法血漿樣品解凍后,渦旋混勻,精密吸取100 μL于離心管中,加入內(nèi)標200 μL,渦旋混勻,加入提取液(正己烷二氯甲烷異丙醇100∶50∶3)3 mL,6 000 r·min-1離心10 min,轉(zhuǎn)移上層有機相于另一離心管中,40 ℃液氮氣吹干,殘渣用100 μL 流動相復(fù)溶,取20 μL 進樣HPLC測定。

        263對照溶液的配制精密稱取羥喜樹堿對照品496 mg,置于50 mL量瓶中,乙腈超聲溶解,定容至刻度線。分別量取01,02,05,10,20 mL置于25 mL量瓶中,用流動相定容至刻度線,得質(zhì)量濃度為0396 8,0793 6,1984,3968,7936 mg·L-1的對照品溶液。各濃度分別繼續(xù)取01 mL置于10 mL量瓶中,得質(zhì)量濃度為3968,7936,1984,3968,7936 μg·L-1的系列對照溶液,冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        264內(nèi)標溶液的制備精密稱取喜樹堿30 mg,置于100 mL量瓶中,加入一定量的DMSO溶解后乙腈定容至刻度線,搖勻。精密量取10 mL內(nèi)標儲備液置于100 mL量瓶中,乙腈定容至刻度線即得03 mg·L-1的內(nèi)標溶液。

        265標準曲線的制備于100 μL空白大鼠血漿中加入系列對照溶液,并分別加入內(nèi)標溶液50 μL,按照262項下進行處理,進樣測定。記錄羥喜樹堿峰面積(As)與內(nèi)標的峰面積(Ai),以As與Ai之比對質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸,得回歸方程C=20147As/Ai-092,r=0999 0;線性范圍3968~7936 μg·L-1。

        266日內(nèi)及日間精密度分別配制低、中、高(3968,1984,7936 μg·L-1)3個質(zhì)量濃度的血漿樣品,按照262方法處理。各濃度在1 d內(nèi)連續(xù)測定5次,得日內(nèi)精密度。各濃度連續(xù)測定5 d,每天1次,得日間精密度。低、中、高濃度日內(nèi)精密度RSD分別為69%,51%,56%。低、中、高濃度日間精密度RSD分別為90%,67%,52%。

        267回收率實驗分別配制低、中、高(3968,1984,7936 μg·L-1)3個質(zhì)量濃度的血漿樣品,按照262方法處理。進樣分析,計算測定值及回收率。結(jié)果顯示低、中、高3個質(zhì)量濃度平均回收率分別為9072%,9204%,9447%。

        268血漿樣品穩(wěn)定性試驗將含藥血漿樣品置于-20 ℃冰箱保存,分別于0,5,10,20 d按照262項下處理,并進樣測定其濃度。結(jié)果顯示,濃度波動無統(tǒng)計學(xué)意義,表明血漿樣品在-20 ℃冰箱保存20 d內(nèi)穩(wěn)定。

        27大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

        271實驗方案取SD大鼠18只,隨機分為3組,每組6只,實驗之前12 h禁食不禁水。分別灌胃給予羥喜樹堿原料藥混懸液、羥喜樹堿固體分散體和羥喜樹堿磷脂復(fù)合物固體分散體,給藥劑量以羥喜樹堿計為3 mg·kg-1。分別于0133,025,033,05,075,10,15,20,30,50,80 h眼眶取血06 mL,置于肝素化離心管中,3 000 r·min-1離心3 min,以262項下處理進樣測定血藥濃度,并繪制血藥濃度時間曲線。

        272數(shù)據(jù)分析達峰時間(Tmax)和達峰濃度(Cmax)均采用實測值,藥時曲線下面積(AUC0~∞)采用梯形法計算,數(shù)據(jù)以±s的形式表示。

        3結(jié)果

        31X射線衍射(XRD)分析

        結(jié)果見圖1。HCPT原料藥具有明顯的晶體衍射,表明HCPT主要以結(jié)晶型存在。HCPTSD和HCPTPCSD 2種固體分散體表現(xiàn)出典型的無定型結(jié)構(gòu)峰,HCPT的晶體衍射峰完全消失,說明HCPT以無定形態(tài)高度分散在2種固體分散體的載體材料中,使HCPT自身的晶體衍射峰被抑制,從而表現(xiàn)出無定型結(jié)構(gòu)峰,有利于HCPT溶解度的改善及溶出速率的增加。而物理混合物仍有HCPT的晶體衍射峰存在,表明成功制備了不同于物理混合物的HCPTSD和HCPTPCSD 2種固體分散體。

        32表觀溶解度實驗

        HCPT 2種固體分散體溶解度結(jié)果見表1。由結(jié)果可知,HCPTSD和HCPTPCSD的表觀溶解度分別為(3021±057),(5723±033)mg·L-1,與HCPT表觀溶解度相比都得到極顯著性提高

        (P<001)。另外,與HCPTSD表觀溶解度相比,HCPTPCSD的表觀溶解度有顯著性提高(P<005),表明將HCPT制備成HCPTPC,并進一步制備成固體分散體后能進一步增加HCPT的表觀溶解度。

        33體外溶出實驗

        HCPT 2種固體分散體體外溶出實驗結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,HCPT 2種固體分散體在50 min左右累積溶出度達到80%以上,而HCPT原料藥90 min內(nèi)累積溶出度僅為2192%。HCPTPCSD的累積溶出度高于HCPTSD,這可能與其表觀溶解度高于HCPTSD有關(guān)。

        34HCPT 2種固體分散體體內(nèi)藥動學(xué)研究[12]

        將ig給藥后的各組大鼠血漿按262項下方法處理,261項下色譜條件檢測HCPT的量,并繪

        制血藥濃度時間曲線,結(jié)果見圖3,各主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。HCPT的2種固體分散體的Cmax,AUC0t,AUC0∞與原料藥相比都有顯著性提高。Cmax由(2741±455) μg·L-1分別顯著性提高到(4276±479),(6316±524) μg·L-1。HCPTSD的AUC0t與原料藥相比提高17687%;而HCPTPCSD提高27259%,12 h后仍可檢測到少量HCPT。而且HCPTPCSD的AUC0t或AUC0∞與HCPTSD相比具有顯著性差異(P<005)。另外,HCPTPCSD的Tmax與HCPT和HCPTSD的Tmax相比有顯著性延長。研究結(jié)果表明2種固體分散體的制備均有助于增加HCPT的吸收和進入體循環(huán)的量,從而提高口服生物利用;而HCPTPCSD與HCPTSD相比在增加HCPT口服吸收生物利用度方面更具優(yōu)勢。

        4討論

        HCPT溶解度較差,在水中僅為451 mg·L-1[3]。改善其溶解度及累積溶出度,可提高口服吸收生物利用度。固體分散體技術(shù)用于難溶性藥物提高藥物溶解度及溶出度、提高口服吸收生物利用已受到國內(nèi)外藥學(xué)工作者的普遍關(guān)注。本研究將HCPT分別制備成HCPTSD及HCPTPCSD后,XRD衍射實驗結(jié)果顯示,HCPT在2種固體分散體中以無定型狀態(tài)存在,有助于溶解度和累積溶出度的提高。溶解度實驗結(jié)果顯示,HCPTSD和HCPTPCSD的表觀溶解度分別為(3021±057),(5723±033) mg·L-1,與HCPT表觀溶解度相比都得到極顯著性提高(P<001)。體外溶出實驗結(jié)果表明,2種固體分散體在50 min內(nèi)累積溶出度達到80%以上,而HCPT原料藥90 min內(nèi)累積溶出度僅為2192%。HCPT溶解度及累積溶出度的改善為提高其口服吸收生物利用奠定了基礎(chǔ)。

        SD大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究結(jié)果顯示,HCPT的2種固體分散體的Cmax,AUC0t,AUC0∞與原料藥相比都有顯著性提高。HCPTSD和HCPTPCSD的AUC0t與原料藥相比提高17687%,27259%。HCPTPCSD的Tmax與HCPT和HCPTSD的Tmax相比有顯著性延長,這可能是因為磷脂復(fù)合物增加了HCPT的脂溶性,經(jīng)胃腸道黏膜上皮細胞時因其較強的脂溶性而暫時滯留于其中,磷脂復(fù)合物中的藥物則持續(xù)緩慢釋放入血液循環(huán)[6],因而HCPTPCSD的Tmax有顯著性延長。HCPTPCSD的AUC0t或AUC0∞與HCPTSD相比具有顯著性增加(P<005)。這可能是因為藥物有良好的水溶性,適度的脂溶性才能較好地經(jīng)黏膜吸收,HCPTSD只增加了HCPT的水溶性;而HCPTPCSD不僅增加了HCPT的脂溶性(磷脂復(fù)合物技術(shù)),同時也增加了水溶性(固體分散體技術(shù))[12],因而HCPTPCSD與HCPT SD相比更具有增加口服吸收生物利用度的優(yōu)勢。采用磷脂復(fù)合物與固體分散體聯(lián)用技術(shù)為改善一些中藥成分生物活性較強而體內(nèi)吸收較差較差,提高其口服吸收生物利用度提供了新的策略。

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        [責(zé)任編輯曹陽陽]

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