謝彤 周學(xué)平 林麗麗 徐建亞 沈存思 馮哲 周玲玲 單進(jìn)軍

[摘要]采用基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS/MS）的代謝組學(xué)方法，分析雷公藤?gòu)?fù)方配伍前后對(duì)大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物的變化，以期闡明基于“異類(lèi)相制”中醫(yī)理論的清絡(luò)通痹方對(duì)雷公藤的配伍減毒機(jī)制。通過(guò)GCMS/MS分析獲得空白對(duì)照組、雷公藤組和清絡(luò)通痹方組大鼠血漿代謝輪廓，正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）顯示3組在得分圖上區(qū)分明顯， 清絡(luò)通痹方組各觀(guān)測(cè)值存在著向正常組移動(dòng)的趨勢(shì)，提示了清絡(luò)通痹方的配伍減毒功效。通過(guò)變量重要性投影（VIP）值和單因素方差分析篩選差異性代謝物，發(fā)現(xiàn)雷公藤組中生糖氨基酸包括丙氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸等水平顯著升高，支鏈氨基酸纈氨酸和異亮氨基酸水平下降，清絡(luò)通痹方則能夠逆轉(zhuǎn)氨基酸水平的紊亂。進(jìn)一步的代謝通路分析提示清絡(luò)通痹方配伍減毒機(jī)制可能與谷氨酸和谷氨酰胺代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝相關(guān)。該研究從代謝的角度，說(shuō)明了雷公藤肝臟毒性的發(fā)生與氨基酸代謝，能量代謝等過(guò)程密切相關(guān)，而清絡(luò)通痹方通過(guò)改善機(jī)體氨基酸水平發(fā)揮配伍減毒作用。

[關(guān)鍵詞]異類(lèi)相制；雷公藤；代謝組學(xué)；肝毒性；清絡(luò)通痹方

雷公藤作為中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的一種常用中藥，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)的功效，臨床上廣泛用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性腎炎等疾病。盡管雷公藤治療免疫系統(tǒng)疾病療效確切，卻存在明顯的肝毒性[12]。雷公藤的臨床治療窗較窄，對(duì)機(jī)體毒性損傷嚴(yán)重，是目前亟需解決的問(wèn)題。在國(guó)醫(yī)大師周仲瑛的指導(dǎo)下，南京中醫(yī)藥大學(xué)周學(xué)平教授以臨床實(shí)踐為基礎(chǔ)，提出 “異類(lèi)相制”的學(xué)術(shù)指導(dǎo)，即通過(guò)具有不同功效的中藥配伍來(lái)制約雷公藤毒烈偏頗之性的效用[34]。在此基礎(chǔ)上，周學(xué)平教授用青風(fēng)藤15 g，生地15 g，三七10 g，僵蠶3 g與雷公藤5～15 g相配伍，組成“清絡(luò)通痹方”。該方在臨床上能夠明顯的降低雷公藤產(chǎn)生的肝毒性。該方中，三七散瘀止血、消腫定痛，生地清熱生津、滋陰養(yǎng)血，與雷公藤配伍能達(dá)到異效相制、扶正制毒的功效。周聰?shù)韧ㄟ^(guò)加減配伍藥對(duì)的方法證實(shí)，在清絡(luò)通痹方中，生地和三七對(duì)正方配伍減毒的功效貢獻(xiàn)度最大[5]。盡管清絡(luò)通痹方配伍減毒的療效確切，然而目前都是從單一的信號(hào)分子通路去研究，缺乏整體的評(píng)價(jià)體系和研究方法。

代謝組學(xué)的發(fā)展給中醫(yī)藥毒性評(píng)價(jià)和毒性機(jī)制研究帶來(lái)新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)[67]。運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)能夠從整體角度評(píng)價(jià)生物體產(chǎn)生的毒性變化，預(yù)測(cè)毒性產(chǎn)生，尋找毒性相關(guān)生物標(biāo)志物，從而闡明毒性機(jī)制。Xiong等建立了GCMS的代謝組學(xué)方法全面表征對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝毒性[8]；Gonzalez等建立的基于液相的代謝組學(xué)方法評(píng)價(jià)急性肝損傷可能發(fā)生的機(jī)制[9]。因此，本文在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)手段來(lái)闡述清絡(luò)通痹方配伍減毒的可能機(jī)制，為“異類(lèi)相制”中醫(yī)理論的科學(xué)內(nèi)涵提供技術(shù)支撐，為其他毒性中藥以及毒性中藥配伍理論的探討提供新的研究思路。

1材料

低溫高速離心機(jī)（Beckman，美國(guó)）；真空旋轉(zhuǎn)揮干儀（Speedvac，Thermo Savant，美國(guó)）；氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS/MS，Thermo，美國(guó)）；氣相毛細(xì)管柱為熔融的硅烷化石英毛細(xì)管（DB5固定相，018 mm×10 m，018 μm，Thermo，美國(guó)）。

1，213C2肉蔻酸（同位素內(nèi)標(biāo)）、鹽酸甲氧胺、吡啶、三甲基氯硅烷（TMCS）、N甲基N三甲基硅烷三氟乙酰胺（MSTFA）均購(gòu)自SigmaAldrich，MSTFA含1%TMCS；甲醇和正庚烷（色譜純）均購(gòu)自Merck公司（德國(guó)）；超純水（自制，Millipore，美國(guó)）；各鑒定用對(duì)照品、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA2Na）等其他試劑均為分析純。

雷公藤藥材產(chǎn)自四川西昌，批號(hào)120620；三七、地黃、僵蠶、青風(fēng)藤藥材均購(gòu)自安徽亳州中藥飲片廠(chǎng)，批號(hào)111208。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室劉圣金博士鑒定，均符合2015年版《中國(guó)藥典》一部中相關(guān)規(guī)定。

雌性SD大鼠30只，體重（200±20） g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）20120001。

2方法

21動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，30只雌性SD大鼠在屏障環(huán)境中適應(yīng)7 d，自由攝取食和水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將大鼠隨機(jī)分成3組，空白對(duì)照組、雷公藤組和清絡(luò)通痹方組，每組10只。每天早晨灌胃給藥10 mL·kg-1，連續(xù)28 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取大鼠血漿于離心管中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

22藥材提取臨床上雷公藤常用劑量為008～025 g·kg-1·d-1，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10倍臨床劑量的雷公藤能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生穩(wěn)定、明顯的肝毒性（即08～25 g·kg-1·d-1），推算至相應(yīng)的大鼠劑量為5～15 g·kg-1·d-1，因此本實(shí)驗(yàn)選用雷公藤劑量為15 g·kg-1·d-1（即臨床最大劑量的10倍）。復(fù)方中其他配伍中藥仍然按照臨床劑量進(jìn)行給藥。

雷公藤提取：稱(chēng)取雷公藤1 500 g，加水12 L，水煎煮提取2次，每次2 h，放冷，合并2次濾液，濾過(guò)。濾液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，濃縮液置于1 000 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器和殘?jiān)?，洗液置于同一量瓶中，加水至刻度，搖勻。得到雷公藤生藥的質(zhì)量濃度為15 g·mL-1，置于4 ℃冰箱，備用。

清絡(luò)通痹方提取：稱(chēng)取雷公藤1 500 g、生地150 g、僵蠶30 g、青風(fēng)藤150 g、三七100 g，混合，加水12 L，水煎提取2次，每次2 h，放冷，合并2次濾液，濾過(guò)。濾液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，濃縮液置于1 000 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器和殘?jiān)?，洗液置于同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，得到清絡(luò)通痹方（方中雷公藤生藥的質(zhì)量濃度為15 g·mL-1）。置于4 ℃冰箱，備用。

23血漿樣品處理取大鼠血漿50 μL于15 mL離心管中，加入150 μL甲醇（含內(nèi)標(biāo)1，213C肉蔻酸25 mg·L-1），渦旋5 min后17 000 r·min-1離心10 min，取上清100 μL置于離心濃縮儀中揮干。向上述樣品中加入30 μL甲氧胺吡啶溶液（10 g·L-1），渦旋1 min后震蕩15 h。加入30 μL BSTFA（含體積分?jǐn)?shù)為1%TMCS）溶液后，取上清用于GCMS/MS進(jìn)樣分析。

24氣相色譜質(zhì)譜條件載氣為氦氣，流速12 mL·min-1，分流比為20∶1，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，傳輸線(xiàn)溫度為250 ℃。EI離子源，溫度為280 ℃。電離能為70 eV，質(zhì)譜采用一級(jí)全掃描的采集方式，m/z采集范圍50～500，采集時(shí)間35～19 min。程序升溫：起始溫度60 ℃，保持1 min后，以20 ℃·min-1速度升至320 ℃后，保持5 min。進(jìn)樣量為1 μL。

25數(shù)據(jù)處理將各色譜峰的EI碎裂圖譜與NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)內(nèi)源性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定。利用Xcalibur 21軟件（Thermo，美國(guó)）對(duì)色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行相對(duì)定量。多元數(shù)據(jù)分析和建模均采用SIMCAP 120軟件（Umetrics， Sweden）完成。采用偏最小二乘判別分析（OPLSDA）來(lái)區(qū)分各組的樣本。最終用Splot以及VIP值來(lái)篩選差異性的代謝產(chǎn)物，并通過(guò)單因素方差分析最終確定差異內(nèi)源性成分。

3結(jié)果與討論

31雷公藤肝毒性以及清絡(luò)通痹方配伍減毒生化結(jié)果生化檢測(cè)結(jié)果表明，雷公藤提取物能夠顯著引起血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）以及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的升高，而清絡(luò)通痹方則能夠逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)氨酶的升高，提示該劑量下的雷公藤能夠誘發(fā)產(chǎn)生肝毒性，而清絡(luò)通痹方則能夠產(chǎn)生配伍減毒的作用，見(jiàn)圖1。

32血漿中內(nèi)源性小分子化合物的測(cè)定在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中優(yōu)化了進(jìn)樣量以及分流比，發(fā)現(xiàn)在分流的情況下，以20∶1的分流比進(jìn)樣，各色譜峰之間分離度較好，峰形佳。經(jīng)過(guò)GCMS/MS分析得到血清總離子流圖，見(jiàn)圖2A。所得每個(gè)質(zhì)譜碎裂圖與NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)比對(duì)，共鑒定出72個(gè)化合物，其中包含了大量的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，例如氨基酸、糖類(lèi)、脂肪酸以及三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物等。

33雷公藤及清絡(luò)通痹方對(duì)機(jī)體代謝的影響將空白對(duì)照組、雷公藤組和清絡(luò)通痹方組進(jìn)行OPLSDA分析，得到2個(gè)主成分的模型分析（R2X：868%，Q2：647%），二維得分圖見(jiàn)圖2B。從圖中可以看到，雷公藤組、清絡(luò)通痹方組與空白對(duì)照組區(qū)分較為明顯，提示相比空白對(duì)照組，雷公藤組改變了正常大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物的水平，驗(yàn)證了雷公藤具有明顯的肝臟毒性；以主成分1為參照，清絡(luò)通痹方組大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物具有向空白對(duì)照組移動(dòng)的趨勢(shì)，說(shuō)明復(fù)方配伍能夠逆轉(zhuǎn)雷公藤誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝毒性。

34差異化合物的篩選分別比較了空白對(duì)照組和雷公藤組，以及雷公藤組和清絡(luò)通痹方組，繪制Splot圖，以VIP值大于10為標(biāo)準(zhǔn)尋找差異化合物，見(jiàn)圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和雷公藤組相比，葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺對(duì)模型的貢獻(xiàn)比較大；雷公藤組與清絡(luò)通痹方組比較，草酸、乳酸、葡萄糖、尿素、半乳糖醛酸、丙氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸和脯氨酸對(duì)模型的貢獻(xiàn)度較大。

35代謝通路分析肝臟是氨基酸代謝的中心器官，肝臟發(fā)生損傷后，常發(fā)生氨基酸代謝的紊亂。使用Metabo Analyst 30 軟件（http：//www. metaboanalyst. ca/）進(jìn)行了代謝通路分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)模型中谷氨酸和谷氨酰胺代謝通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝影響較大，見(jiàn)圖4。谷氨酰胺、丙氨酸、絲氨酸以及脯氨酸是機(jī)體的生糖氨基酸。雷公藤誘導(dǎo)產(chǎn)生肝毒性，蛋白質(zhì)產(chǎn)生分解，使得部分的生糖氨基酸游離至血漿。清絡(luò)通痹方能夠逆轉(zhuǎn)氨基酸水平的升高，提示了配伍減毒的功效。相反，支鏈氨基酸纈氨酸和異亮氨基酸水平顯著降低[10]。慢性肝毒性的發(fā)生往往伴隨支鏈氨基酸合成異常，支鏈氨基酸作為肝毒性的指標(biāo)之一，提示肝毒性的產(chǎn)生，而清絡(luò)通痹方并沒(méi)有能夠逆轉(zhuǎn)支鏈氨基酸的降低，說(shuō)明清絡(luò)通痹方中其他成分可能會(huì)導(dǎo)致氨基酸的降低。

氨基酸代謝異常也影響機(jī)體的尿素水平。雷公藤導(dǎo)致機(jī)體蛋白降解，氨基酸水平升高，使得氨基酸脫氨基代謝增加，從而表現(xiàn)出尿素水平的升高。清絡(luò)通痹方配伍后，尿素水平顯著降低。

文獻(xiàn)報(bào)道雷公藤中的主要成分雷公藤甲素抑制線(xiàn)粒體功能從而產(chǎn)生肝毒性。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雷公藤誘導(dǎo)使得機(jī)體的葡萄糖水平顯著上升，說(shuō)明線(xiàn)粒體利用葡萄糖氧化產(chǎn)能受阻，表明雷公藤影響了能量代謝。3羥基丁酸是一種酮體，雷公藤抑制線(xiàn)粒體能量代謝，使得糖異生代謝途徑增加，酮體作為一種能量源，進(jìn)入糖異生代謝通路，產(chǎn)能供機(jī)體使用，最終使得3羥基丁酸的含量降低，見(jiàn)圖5。

4討論

中醫(yī)在“七情”以及“君臣佐使”的理論基礎(chǔ)上合理配伍中藥，采用復(fù)方治療各種疾病。本實(shí)驗(yàn)采用代謝組學(xué)技術(shù)手段，從整體微觀(guān)角度描述了雷公藤?gòu)?fù)方配伍前后大鼠血漿代謝輪廓的變化。研究結(jié)果表明，空白對(duì)照組、雷公藤組和清絡(luò)通痹方組大鼠血漿中內(nèi)源性成分在OPLSDA得分圖中區(qū)分明顯，清絡(luò)通痹方能夠使代謝軌跡從雷公藤肝毒性向正常組轉(zhuǎn)移，提示清絡(luò)通痹方配伍減毒的作用。代謝通路結(jié)果提示，雷公藤主要影響了機(jī)體的氨基酸代謝以及能量代謝，而清絡(luò)通痹方則通過(guò)逆轉(zhuǎn)氨基酸代謝的紊亂發(fā)揮配伍減毒的作用。清絡(luò)通痹方基于中醫(yī)理論“異類(lèi)相制”而提出。配伍方中，三七養(yǎng)血、止血、化瘀?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三七能夠改善肝臟微循環(huán)，促進(jìn)肝臟蛋白質(zhì)合成，從而達(dá)到保肝的作用，在方中發(fā)揮“異效制毒”的功效。這與本文中清絡(luò)通痹方通過(guò)糾正機(jī)體氨基酸水平的紊亂發(fā)揮配伍減毒的作用機(jī)制相符合，提示方中三七可能通過(guò)改善氨基酸代謝發(fā)揮“異效制毒”的機(jī)制。配伍方中，生地滋陰生津、止血抗凝?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，生地改善機(jī)體的糖代謝。本文研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤誘導(dǎo)使得機(jī)體能量代謝異常，葡萄糖、乳酸和羥基丁酸水平下降，而給予清絡(luò)通痹方后，乳酸水平表現(xiàn)升高趨勢(shì)，提示清絡(luò)通痹方可能改善了能量代謝，機(jī)體通過(guò)其他途徑如糖異生等代謝產(chǎn)能。這與方中生地的功效相符合，表明方中生地通過(guò)改善機(jī)體糖代謝發(fā)揮“扶正制毒”的功效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)和分析，從代謝的角度初步闡明雷公藤的肝毒性機(jī)制，進(jìn)而探討其復(fù)方（清絡(luò)通痹方）配伍減毒機(jī)制，從整體微觀(guān)的角度闡明了中醫(yī)遣方用藥以及中醫(yī)理論的科學(xué)內(nèi)涵，為其他毒性中藥的研究提供示范性思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]劉為萍， 劉素香， 唐慧珠， 等 雷公藤研究新進(jìn)展[J] 中草藥， 2010， 41（7）： 1215

[2]劉雪梅， 劉志宏， 張晶， 等 雷公藤臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)的研究進(jìn)展[J] 藥學(xué)實(shí)踐雜志， 2015， 33（2）： 110

[3]李桓， 周學(xué)平， 陸艷 雷公藤“異類(lèi)相制”配伍減毒作用探討[J] 中醫(yī)雜志， 2015， 56（1）： 10

[4]周學(xué)平， 周玲玲， 王旭 基于異類(lèi)相制理論探討中藥復(fù)方的配伍減毒作用[J] 中醫(yī)雜志， 2013， 54（4）： 271

[5]周聰， 周玲玲， 柳璋璞， 等 基于肝毒性的雷公藤?gòu)?fù)方配伍減毒作用及機(jī)制研究[J] 中藥藥理與臨床，2013， 29（5）： 106

[6]Wanichthanarak K， Fahrmann J F， Grapov D Genomic， proteomic， and metabolomic data integration strategies[J] Biomark Insights， 2015， 10（suppl 4）：1

[7]Reily M D， Tymiak A A Metabolomics in the pharmaceutical industry[J] Drug Discov Today Technol， 2015， 13： 25

[8]Xiong Y H， Xu Y， Lang L， et al Gas chromatographymass spectrometrybased profiling of serum fatty acids in acetaminopheninduced liver injured rats[J] J Appl Toxicol， 2014， 34 （2）： 149

[9]Gonzalez E， Liempd S， CondeVancells J， et al Serum UPLCMS/MS metabolic profiling in an experimental model for acuteliver injury reveals potential biomarkers for hepatotoxicity[J] Metabolomics， 2012， 8（6）： 997

[10]孔祥鵬， 裴妙榮， 鄧亮， 等 逍遙散干預(yù)肝損傷小鼠的代謝組學(xué)研究[J] 中成藥， 2014， 36（1）： 171

[責(zé)任編輯曹陽(yáng)陽(yáng)]