張淑麗 王怡萍 杜振霞 薛夢?┱漚開┞砣?

[摘要]利用脂質代謝組學技術，研究果糖誘導高尿酸血癥大鼠與正常大鼠血清中脂類代謝物的變化，篩選出與高尿酸血癥相關的潛在生物標記物。通過超高效合相色譜四極桿飛行時間質譜聯(lián)用（UPC2Q/TOFMS）技術分析高尿酸血癥大鼠（模型組）和正常大鼠（對照組）血清代謝譜圖，采用多元統(tǒng)計分析方法比較2組的代謝譜差異，篩選出差異性代謝物。結果顯示，模型組和對照組的代謝譜圖存在明顯差異，并篩選出11個差異代謝物，利用精確質量數(shù)結合二級質譜圖初步確定了花生四烯酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸等8種潛在生物標記物。該文建立了基于UPC2Q/TOFMS技術進行果糖誘導高尿酸血癥大鼠血清脂質代謝組學研究的方法，推測脂肪酸代謝異常可能與高尿酸血癥的發(fā)病機制有關，為高尿酸血癥的早期診斷和預防奠定科學基礎。

[關鍵詞]果糖；高尿酸血癥；脂質代謝組學；生物標記物

近年來隨著人們生活水平和飲食結構的改變，高尿酸血癥及其相關疾病的發(fā)病率也急劇增加[1]。作為世界范圍內一般人群中患病率較高的代謝性疾病，高尿酸血癥在當前并未引起足夠重視[2]。毒理病理學研究證實，脂代謝紊亂與代謝性疾病如糖尿病、腎病等具有相關性[34]，例如，尿酸與血脂代謝紊亂之間存在密切關系[58]。脂質代謝組學（lipidomics）作為最重要的代謝組學分支，在脂質代謝疾病的預防和診斷，脂質生物標志物、藥物靶點的鑒定以及藥物研發(fā)等方面都取得了重要進展[910]。

高尿酸血癥和痛風患病率的增加與含果糖飲料的消耗增加有關[1112]。動物實驗研究也表明，與其他糖類不同，高果糖飲食可引起嚙齒類動物血尿酸水平快速升高[1316]，因此本實驗采用文獻造模方法[17]。本文應用建立的UPC2Q/TOFMS脂質代謝組學方法研究果糖誘導高尿酸血癥大鼠血清代謝物的改變，確定其潛在的生物標記物，以期為高尿酸血癥的早期診斷和預防提供依據(jù)。

1材料與方法

11儀器與試劑超高效合相色譜四極桿飛行時間質譜聯(lián)用儀（UPC2Q/TOFMS，美國Waters公司）；ACQUITY UPC2TM HSS C18 SB色譜柱（30 mm×100 mm，18 μm）；低溫高速離心機（GL21M，上海盧湘儀公司）。

D果糖（AMRESCO）；血尿酸試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20150227）；甲酸、醋酸銨、異丙醇（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；氯仿、甲醇、乙腈均為分析純；超純水（MilliQ純水機自制，美國Millipore公司）。

12動物分組與造模SD大鼠，雄性，體重（240±20） g，購自北京維通利華實驗動物中心，動物合格證號SCXK（京）20120001。

SD雄性大鼠16只，適應性喂養(yǎng)5 d后，按質量隨機分為對照組和模型組，每組8只，喂飼普通飼料，同時對照組飲去離子水，模型組飲10%果糖水。2組動物均自由飲食、飲水，飼料和水每天更換1次，并記錄飲水量。造模期間，每7 d尾靜脈取血一次，連續(xù)21 d。

13生化學檢查取靜脈血1 mL，按尿酸試劑盒說明書操作。

14樣本的預處理與UPC2Q/TOFMS分析條件靜脈血3 mL，于4 ℃下4 000 r·min-1離心15 min，取上清液放入-20 ℃冰箱待用。取80 μL血清加入15 mL EP管中，加入320 μL氯仿甲醇（3∶1）渦旋2次，每次15 s，10 000 r·min-1常溫離心10 min，取上清液10 μL注入液質聯(lián)用儀進行分析。

色譜條件：ACQUITY UPC2TM HSS C18 SB色譜柱（30 mm×100 mm，18 μm）；流動相A為CO2，流動相B為02%甲酸[異丙醇甲醇（6∶1）溶液]，梯度洗脫，0～05 min，99%A，05～9 min，99%～60%A，9～10 min，60%A，10～11 min，60%～99%A，11～13 min，99%A，流速15 mL·min-1；柱溫40 ℃。

質譜條件：采用Xevo G2S QTOFMS質譜系統(tǒng)，掃描范圍m/z 50～1 200，離子化模式電噴霧電離（ESI），采用負離子V模式檢測，毛細管電壓2 500 V，離子源溫度120 ℃，霧化氣溫度450 ℃，錐孔氣流速50 L·h-1。

15數(shù)據(jù)處理利用Markerlynx V 41軟件對原始數(shù)據(jù)進行校正和歸一化處理，應用SIMCAP 1303軟件（Umctrics Sweden）對樣品進行分組和（正交）偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）。分析結果以二維和三維得分圖和Splot圖表示。以VIP>1的成分作為對模型具有明顯值貢獻的標記物。組間比較采用t檢驗，篩選P<005的數(shù)據(jù)得到有意義的變量。

2結果

21生化指標造模第7天時，2組血清尿酸值開始出現(xiàn)明顯差異（P<001）。造模14，21 d后的2組血清尿酸值保持明顯差異（P<005），說明在實驗期間模型穩(wěn)定，選擇造模7 d的數(shù)據(jù)進行脂質代謝組學分析，結果見表1。

22血清樣品的LCMS分析利用ESI負離子模式分別采集對照組和模型組大鼠血清樣本數(shù)據(jù)，得到血清樣本的BPI圖，見圖1。所有代謝物在13 min內就能得到很好的分離，且2組的輪廓明顯不同。為保證數(shù)據(jù)的可靠性，在數(shù)據(jù)采集過程中，每間隔6個樣品，使用質控樣品進樣1次，以監(jiān)測采集系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

23數(shù)據(jù)分析采用OPLSDA對Markerlynx導出的數(shù)據(jù)進行分型，結果見圖2，3。各組血清數(shù)據(jù)分析的Splot圖見圖4，模型組與對照組分離明顯，S型曲線兩端的數(shù)據(jù)對分別代表每個樣本組可信度最高的特征離子，即潛在生物標記物。

24生物標記物的發(fā)現(xiàn)與鑒定經(jīng)OPLSDA分析，選取VIP>1的差異變量，采用t檢驗對篩選的差異變量在對照組與模型組進行驗證，只有P<005的變量可作為與高尿酸血癥大鼠相關的潛在生物標記物，參照有關文獻并根據(jù)一級、二級質譜信息，利用HMDB（http：//wwwhmdbca/）和LIPID MAPS（http：//wwwlipidmapsorg/）等數(shù)據(jù)庫，以m/z 303277 4的離子為例，使用精確相對分子質量數(shù)據(jù)檢索，再通過ESI負模式下的二級碎裂方式推測代謝物結構，碎裂方式為：m/z 303277 4 [M-H]-，25956[M-CH2O3-H]-，5893[C2H3O2]-，見圖5。通過LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫MS/MS譜圖和花生四烯酸對照品對比，m/z 303277 4的離子被鑒定為花生四烯酸，其他10種代謝物使用類似方法鑒別，見表 2。

3討論與結論

UPC2Q/TOFMS技術在分離能力、分析時間及靈敏度方面較常規(guī)液質聯(lián)用（LCMS）有很大優(yōu)勢，分析鑒定能力強，可實現(xiàn)快速分離，能獲得包含更多數(shù)目的代謝譜圖[18]。其無需對脂質樣品進行衍生化處理[19]，直接有機相溶解后進樣分析，簡化了工作流程，同時可快速解析出脂質的結構，因此本實驗選擇UPC2QTOF/MS的脂質代謝組學技術。

本實驗發(fā)現(xiàn)脂肪酸FA（C16∶1），F(xiàn)A（C16∶0），F(xiàn)A（C18∶1）含量模型組高于對照組，F(xiàn)A（C20∶4），F(xiàn)A（C24∶0），F(xiàn)A（C24∶1）含量低于對照組。

脂肪酸的合成與利用，加速ATP的分解，使HUA生成增加，從而產生高尿酸血癥[20]。飽和脂肪酸攝入過多是導致高胰島素血癥的危險因素[21]，尤其是棕櫚酸（C16∶0）[6]。另外不飽和脂肪酸花生四烯酸、類花生酸類物質、脂質過氧化物的快速產生和蓄積，而花生四烯酸是體內白三烯生物合成的前體物質，白三烯與許多炎癥有關，包括痛風[22]。有研究表明血清脂肪酸在反映機體脂代謝方面比TG，TC敏感，在單純高尿酸血癥階段，需注意檢測血清脂肪酸濃度的變化，盡早糾正血清脂肪酸及脂代謝紊亂，避免動脈粥樣硬化的發(fā)生[23]。本實驗結果表明脂肪酸代謝異?？赡芘c高尿酸血癥的發(fā)病機制有關，從脂質代謝組學角度為高尿酸血癥與代謝綜合征的相關性提供了依據(jù)。

本研究應用UPC2Q/TOFMS的脂質代謝組學方法分析果糖誘導高尿酸血癥大鼠與正常大鼠血清的脂類代謝物變化，并對其進行多元統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥大鼠模型血清中脂肪酸類成分發(fā)生變化。該方法無需對樣品進行衍生化處理，工作流程簡化，達到快速區(qū)分高尿酸血癥大鼠和對照組大鼠的目的，并發(fā)現(xiàn)了部分潛在生物標記物，為從代謝通路的角度闡述其發(fā)病機制及高尿酸血癥的早期診斷和預防奠定了基礎。

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[責任編輯曹陽陽]