郝偉偉，胥燕芳，方鵬飛，廖韋萍

（四川省華派生物制藥有限公司，四川簡(jiǎn)陽(yáng)　641401）

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一株雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定

郝偉偉，胥燕芳，方鵬飛，廖韋萍

（四川省華派生物制藥有限公司，四川簡(jiǎn)陽(yáng)641401）

摘要：本試驗(yàn)采集某養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)病雞的腎臟和肺組織病料，接種雞胚盲傳，發(fā)現(xiàn)從F3代開(kāi)始出現(xiàn)侏儒胚及發(fā)育不良的雞胚，經(jīng)病毒血凝性測(cè)定、干擾NDV試驗(yàn)、RT-PCR鑒定，判定該病毒為雞傳染性支氣管炎病毒，命名為HP-W株。對(duì)該分離株的S1基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，結(jié)果表明該毒株的S1基因長(zhǎng)度為1620bp，與變異株4/91的核苷酸同源性為98.9%，氨基酸同源性為98.1%，與其他毒株核苷酸及氨基酸序列的同源性均低于80%。

關(guān)鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒；分離；鑒定

雞傳染性支氣管炎（IB）簡(jiǎn)稱(chēng)雞傳支，是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病[1]，是家禽二類(lèi)傳染病，也是危害世界養(yǎng)禽業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一。該病毒主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及泌尿生殖系統(tǒng)，造成雞咳嗽、噴嚏、氣管啰音、呼吸困難、腸炎、產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降等癥狀[2-3]。雞傳染性支管炎的臨床分型主要包括呼吸型、生殖型（又稱(chēng)產(chǎn)蛋雞變異型）、腎型、腺胃型等，并不斷產(chǎn)生新的基因型[4]。IBV經(jīng)常同大腸桿菌、NDV 及AIV混合感染雞群，混合感染后的病情比單一感染更加嚴(yán)重，常導(dǎo)致極高的發(fā)病率和死亡率，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[5-6]。本試驗(yàn)從一混合感染禽流感H9亞型病毒的病料中分離得到一株傳染性支氣管炎病毒，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病料四川眉山市某大型養(yǎng)雞場(chǎng)21日齡商品肉雞群發(fā)生疫情。病雞主要表現(xiàn)為食欲下降，精神萎頓，張嘴呼吸、氣管有啰音；病情持續(xù)一周，雞群發(fā)病率約50%，死亡率約10%；剖檢后，大多數(shù)病死雞的支氣管內(nèi)有黃色干酪樣栓塞。無(wú)菌采集發(fā)病雞的腎臟及肺組織作為病料保存。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物SPF蛋和SPF雞購(gòu)自濟(jì)南禽業(yè)科技有限公司，SPF蛋購(gòu)買(mǎi)后由實(shí)驗(yàn)室孵化，SPF雞飼養(yǎng)在隔離器中。

1.1.3 H9亞型禽流感陽(yáng)性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。

1.1.4新城疫LaSota株病毒購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.5生化試劑Trizo1 Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；RNA PCR Kit、Mix、D2000 DNA Marker、膠回收試劑盒均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖購(gòu)自GIBCO公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病料處理無(wú)菌取病料，剪碎，按1g∶5 mL加入滅菌PBS液（pH值7.2），在研缽中充分研磨，研磨后的病料凍融3次，以3 000r/min離心10min，取上清液經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾。

1.2.2疾病診斷

1.2.2.1病毒繁殖及傳代。將處理好的病料上清液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.1mL/胚，同樣的方法用PBS液接種雞胚作為陰性對(duì)照。接種后將雞胚置37℃溫箱中繼續(xù)孵育。每24h觀察雞胚1次，棄掉24h內(nèi)死亡胚，收集120h內(nèi)的死胚和部分活胚（4℃致死），收獲尿囊液（記為E1代）進(jìn)行傳代。剩余活胚培養(yǎng)至144h，觀察雞胚病變。

1.2.2.2 HA試驗(yàn)。按常規(guī)微量法對(duì)傳代尿囊液進(jìn)行HA測(cè)定。

1.2.2.3 RT-PCR檢測(cè)。對(duì)有血凝性的尿囊液采用Trizo1法提取RNA，分別以H9亞型AIV、NDV、IBV特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

1.2.3雞傳染性支氣管炎病毒分離取一定體積處理過(guò)的病料于管制瓶中，加入等體積H9亞型禽流感陽(yáng)性血清，37℃中和1h。將中和的病毒液接種10日齡雞胚尿囊腔，0.2mL/胚，同樣的方法用PBS液接種雞胚作為陰性對(duì)照。接種后將雞胚置37℃溫箱中繼續(xù)孵育。每24h觀察雞胚1次，棄掉24h內(nèi)死亡胚，收集36～48h內(nèi)的死胚和部分活胚（4℃致死），收獲HA陰性尿囊液（記為F1代）進(jìn)行傳代。剩余活胚培養(yǎng)至144h，觀察雞胚病變。

1.2.4雞傳染性支氣管炎病毒鑒定

1.2.4.1病毒血凝性測(cè)定。試驗(yàn)共分為4組，A組：取F6代雞胚尿囊液，加1%胰酶；B組：取F6代雞胚尿囊液，不加胰酶；C組：取PBS液接種10日齡雞胚，48h收獲尿囊液加1%胰酶；D組：取PBS液接種10日齡雞胚，48h收獲尿囊液不加胰酶。四個(gè)試驗(yàn)組均置于37℃下處理4h，然后按常規(guī)微量法測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)。

1.2.4.2干擾NDV試驗(yàn)。將10日齡健康雞胚分為4組（分組情況見(jiàn)表1），接種后于37℃孵育72h，無(wú)菌收集尿囊液，按常規(guī)方法分別測(cè)定各組血凝（HA）滴度。

表1　干擾NDV試驗(yàn)的雞胚分組

1.2.4.3 S1基因序列測(cè)定參照GenBank已經(jīng)公布的IBV全基因組序列，在進(jìn)行多序列比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，利用IBV基因組S1基因兩端外的保守序列，應(yīng)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于擴(kuò)增包含IBV S1基因序列的一段約1 720 bp的序列。采用Trizo1法提取病毒RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增S1基因，再進(jìn)行電泳，切下目的片段后進(jìn)行膠回收。將回收到的DNA片段送去英濰捷基生物公司進(jìn)行基因測(cè)序，然后把測(cè)序結(jié)果同GenBank上的S1基因cDNA序列進(jìn)行比對(duì)。

2　結(jié)果

2.1疾病診斷

2.1.1雞胚病變病料處理傳代后，第1代出現(xiàn)4枚死胚，其余活胚未觀察到明顯病變，從第3代開(kāi)始出現(xiàn)侏儒胚及發(fā)育不良雞胚，符合雞傳染性支氣管炎典型病變，因此判定病料中含有雞傳染性支氣管炎病毒。

2.1.2 HA試驗(yàn)結(jié)果E1代死胚及個(gè)別活胚尿囊液能夠凝集1%的新鮮雞紅細(xì)胞，E2代尿囊液均能凝集1%的新鮮雞紅細(xì)胞，凝集價(jià)為1∶28～1∶210。懷疑病料中含有新城疫或禽流感病毒。

2.1.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果分別以NDV、H9亞型禽流感AIV、IBV特異性引物用RT-PCR法檢測(cè)尿囊液，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。圖中可見(jiàn)H9亞型AIV及IBV引物均擴(kuò)增出特異性條帶，判定病料中含有H9亞型AIV及IBV。

2.2雞傳染性支氣管炎病毒分離F1代未見(jiàn)明顯病變，從F3代開(kāi)始出現(xiàn)侏儒胚。傳至F6代，雞胚出現(xiàn)穩(wěn)定病變，表現(xiàn)為：胚體發(fā)育明顯受阻，明顯小于正常雞胚，出現(xiàn)卷曲胚、矮小胚、羽毛發(fā)育不良；死亡雞胚有充血、出血的現(xiàn)象，死亡時(shí)間大多在72～120h，死胚尿囊液明顯增多，羊膜增厚，表面混濁，胚體發(fā)生蜷縮，趾爪緊抱頭部（見(jiàn)圖2）。尿囊液HA檢測(cè)均為陰性。將分離到的病毒命名為HP-W株。

圖1　病料RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2　雞胚病變

2.3雞傳染性支氣管炎病毒鑒定

2.3.1病毒血凝性測(cè)定結(jié)果病毒血凝測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示：F6代尿囊液血凝價(jià)為0，經(jīng)1%胰蛋白酶處理后血凝價(jià)為71og2，PBS接種的雞胚尿囊液經(jīng)胰酶處理及未經(jīng)處理的血凝價(jià)均為0。試驗(yàn)表明，該病毒本身不能凝集紅細(xì)胞，但是經(jīng)過(guò)1%胰蛋白酶處理后，能夠使紅細(xì)胞發(fā)生凝集。

2.3.2干擾NDV試驗(yàn)結(jié)果干擾NDV試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。接種分離病毒液及PBS的尿囊液HA均為陰性；同時(shí)接種分離病毒液及NDV LaSota病毒的雞胚尿囊液HA效價(jià)為21og2～41og2；單獨(dú)接種NDV LaSota病毒的雞胚尿囊液HA效價(jià)為91og2～101og2。說(shuō)明分離到的病毒對(duì)NDV LaSota病毒有明顯的干擾作用。

表2　病毒血凝性測(cè)定結(jié)果

表3　干擾NDV試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 RT-PCR鑒定電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中可以看出，F(xiàn)6代尿囊液通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物大小約1700bp，與預(yù)期片段大小相符。使用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收目的片段，并送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，分離的IBV毒株的S1基因長(zhǎng)度為1620bp，編碼540個(gè)氨基酸。

圖3　RT-PCR電泳結(jié)果

選取具有代表性的國(guó)內(nèi)外毒株及疫苗株利用DNAMAN軟件進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)HP-W株S1基因的核苷酸序列與國(guó)內(nèi)使用較廣泛的歐洲呼吸型疫苗株H120、H52的同源性分別為78.7%和78.8%；與美國(guó)腎型、呼吸型代表毒株Ho1te、M41的同源性分別為78.8%和79%；與澳大利亞腎型株T的同源性為79.4%；與臺(tái)灣地區(qū)分離株JP8443、TW97-4的同源性分別為78.4%和77.4%；與國(guó)內(nèi)腎型疫苗株W93和Ji1in的同源性為78.6%和79.1%；與腺胃型毒株CK/CH/LDL/97I的同源性為78.7%；與變異株4/91的同源性為98.9%。HP-W株S1基因編碼的氨基酸序列同變異株4/91的同源性達(dá)98.1%，同其他毒株氨基酸序列的同源性均低于80%。利用軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示該分離株（HP-W株）與現(xiàn)有的呼吸型及腎型疫苗株的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，同變異株4/91有很近的親緣關(guān)系。

3　討論

我國(guó)自從1982年首次分離到IBV后，不斷有IBV變異毒株發(fā)生和流行的報(bào)道[7]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，2010～2012年間，IBV在常見(jiàn)疫病中的檢出率超過(guò)15%，混合感染率也呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，說(shuō)明中國(guó)雞傳支流行越來(lái)越嚴(yán)重[8]。導(dǎo)致這種結(jié)果的主要原因是IBV的變異產(chǎn)生了大量免疫逃逸毒株，或者因?yàn)槌掷m(xù)使用各種各樣的疫苗，出現(xiàn)了大量二重、三重或多重的雜交、變異毒株。IBV變異毒株的抗原性發(fā)生改變，導(dǎo)致其血清型眾多，且新的血清型還在不斷出現(xiàn)，但彼此之間的交叉保護(hù)率較低或不產(chǎn)生交叉保護(hù)，這使得IB的防治越來(lái)越困難。本次從發(fā)病雞腎臟和肺組織中分離得到一株病毒“HP-W”，經(jīng)血凝特性測(cè)定、干擾NDV試驗(yàn)及RT-PCR，鑒定得出所分離到的病毒為雞傳染性支氣管炎病毒。

鑒于IBV的多型性和可變性，且在疾病的傳播過(guò)程中有變異株或新的基因型出現(xiàn)，需要對(duì)IBV的分子流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查分析，掌握其分子流行病學(xué)規(guī)律，了解各個(gè)地區(qū)流行毒株的基因型，有針對(duì)性地選擇疫苗進(jìn)行防控。本研究為疫苗株的篩選提供了試驗(yàn)依據(jù)，為雞傳染性支氣管炎疾病的防控奠定了基礎(chǔ)。

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Isolation and Identification of a Strain of Avian Infectious Bronchitis Virus

HAO Weiwei，XU Yanfang，F(xiàn)ANG Pengfei，et a1.
（Sichuan Huapai Biopharmaceutica1 Co.Ltd.，Sichuan Jianyang 641401，China）

Abstract：Nephridia1 and 1ung tissue of sick chicken co11ected from pou1try yard，were inocu1ated on SPF embryonated chicken eggs for seria1 passages.Dwarf and dysp1asia embryos were observed from 3rd passage.The resu1ts of vira1 hemagg1utination test，interference of NDV test and RT-PCR identification demonstrated that the virus was identified as IBV，named HP-W.S1 gene of this strain was amp1ified and sequenced，we found its 1ength was 1620bp，and the sequence of nuc1eotides and aminoacids shared 98.9% and 98.1% identity with 4/91 strain，but 1ess than 80% with other strains.

Key words：Avian infectious bronchitis virus；Iso1ation；Identification

作者簡(jiǎn)介：郝偉偉（1985—），女，山東濟(jì)寧人，碩士，四川省華派生物制藥有限公司研發(fā)人員，從事禽苗研發(fā)工作。

收稿日期：2015-10-30

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.315.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1001-8964（2016）02-0029-04