王藝華，宋吉利（國家葡萄酒及白酒、露酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東煙臺264003）

?

葡萄酒中白藜蘆醇含量不確定度的評定

王藝華，宋吉利
（國家葡萄酒及白酒、露酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東煙臺264003）

摘要：根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和CNAS—GL06《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》的原理與方法，建立了液相色譜測定葡萄酒中白藜蘆醇含量的數(shù)學(xué)模型。對測量結(jié)果的不確定度來源進(jìn)行分析，分別對A類不確定度和B類不確定度進(jìn)行評定。計(jì)算了各不確定度分量、合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。結(jié)果表明，不確定度主要來源于測量重復(fù)性，其次為量器校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和進(jìn)樣針。

關(guān)鍵詞：不確定度；白藜蘆醇；液相色譜；葡萄酒

近幾年來，不確定度的概念在檢測分析領(lǐng)域日益受到重視[1-2]。1999年12月15日，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）和國際電工委員會（IEC）在共同發(fā)布的ISO/IEC 17025：2005標(biāo)準(zhǔn)[3]中明確規(guī)定，無論是校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室還是測試實(shí)驗(yàn)室，都必須建立并實(shí)施測量不確定度的評估程序，以確保測試結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。這是測試實(shí)驗(yàn)室通過ISO/IEC 17025：2005標(biāo)準(zhǔn)的一道新課題。

白藜蘆醇學(xué)名為1,2-二苯乙烯,它的產(chǎn)生與葡萄植株受真菌的感染或非生物刺激(如紫外輻射)有關(guān)。其多以其單體及糖苷（piceid，3，4'，5-三羥基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷）形式存在，故一般有4種存在形式：順式、反式白藜蘆醇和順式、反式白藜蘆醇糖苷。白藜蘆醇存在于葡萄中也存在于葡萄酒中，在大多數(shù)葡萄酒中反式結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)地位[4-9]。

白藜蘆醇的檢測方法主要有氣相法和液相法，目前多采用GB/T15038—2006[10]標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法。該方法是以高效液相色譜（HPLC）法測定其含量，但因該方法涉及提取、凈化、濃縮等步驟，添加回收率較低，對測定結(jié)果有較大影響，故對該方法進(jìn)行部分改進(jìn)，減少樣品處理步驟，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF 1059.1—2012[11]標(biāo)準(zhǔn)的要求，對利用HPLC法測定葡萄酒中白藜蘆醇含量的不確定度進(jìn)行了分析和評定，并給出了標(biāo)準(zhǔn)的表示方法。

1　材料與方法

1.1材料、儀器和試劑

樣品：煙臺西夫拉姆有限公司生產(chǎn)的迪拉麗·高含量白藜蘆醇干紅葡萄酒。

儀器：Waters 2695高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）、BS210S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

試劑：反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（Stanford Chemicals生產(chǎn)）、乙醇（分析純）、甲醇（分析純），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。除另有規(guī)定外，試劑均為分析純。

1.2測定方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定

a.稱取標(biāo)準(zhǔn)品反式白藜蘆醇0.2000 g，用乙醇（分析純）溶解并定容至100 mL，配制成2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

b.吸取2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL，將乙醇定容至100 mL，配制成40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2樣品的測定

樣品的測定過程包括取樣、制樣和測定3個(gè)步驟。參照GB/T 15038—2006[10]中的檢測方法，優(yōu)化檢測步驟為：移取葡萄酒樣品10.00 mL于100.00 mL容量瓶中，蒸餾水定容。稀釋液過0.45 μm濾膜，濾液即進(jìn)HPLC分析。

1.3數(shù)學(xué)模型

根據(jù)1.2的測定方法，建立葡萄酒中白藜蘆醇含量測定的數(shù)學(xué)模型，如（1）式所示：

式中：X——試樣中白藜蘆醇的含量，mg/L；

C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品溶液中白藜蘆醇的含量，mg/L；

V2——吸取葡萄酒樣品的體積，mL；

V1——樣品稀釋液總體積，mL；

Frec——添加回收率，%；

Frep——重復(fù)性校正因子。

由于葡萄酒系體態(tài)均勻的液體樣品，從而制得有代表性的樣品，故取樣代表性產(chǎn)生的不確定度可以忽略不計(jì)，則（1）式即為白藜蘆醇含量測定的不確定度數(shù)學(xué)模型。

從數(shù)學(xué)模型可以看出，各影響參數(shù)相互獨(dú)立，且各參數(shù)的不確定度直接對被測量X的不確定度產(chǎn)生影響，即靈敏系數(shù)等于1，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以用相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行合成，根據(jù)JJF 1059.1—2012[11]中6.7，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uCrel表示為：

由公式（1）和公式（2）可推導(dǎo)出測試樣品的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式：

2　不確定度的來源分析

計(jì)算不同的不確定度分量時(shí)，應(yīng)利用在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn)研究的測定數(shù)據(jù)。本測定方法不確定度從總體上考慮，分為以下3種：（1）測量重復(fù)性引入的不確定度分量ur（Frep）；（2）總偏差（回收）引入的不確定度分量ur（Frec）；（3）不能全面考慮的其他影響因素有關(guān)的不確定度，主要是樣品測試全過程引入的其他不確定度分量ur。

2.1測量重復(fù)性引入的不確定度分量ur（Frep）

對不同樣品進(jìn)行一系列平行測試（同一均勻樣品、完整的提取/測定程序），以獲得該分析程序的總的隨機(jī)變化（精密度）。

2.2偏差引入的不確定度分量ur（Frec）

分析程序的偏差是通過在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部確認(rèn)研究中使用加料樣品進(jìn)行的研究。

2.3樣品測試全過程引入的不確定度分量ur

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液測定過程引入的不確定度ur（C）

主要包括：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度；稱量產(chǎn)生的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程量器產(chǎn)生的不確定度；10 μL進(jìn)樣針準(zhǔn)確度引入的不確定度；HPLC儀器準(zhǔn)確度引入的不確定度分量。

2.3.2樣品測定過程引入的不確定度ur（V）

主要包括：樣品制備過程量器產(chǎn)生的不確定度；10 μL進(jìn)樣針準(zhǔn)確度引入的不確定度；HPLC儀器準(zhǔn)確度引入的不確定度分量。

3　測量不確定度分量的分析和評定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的來源分別進(jìn)行不確定度的評定。

3.1測量重復(fù)性引入的不確定度分量ur（Frep）

測量重復(fù)性引入的不確定度分量ur（Frep），樣品反復(fù)進(jìn)行10次分析，見表1。

表1 測量重復(fù)性引入的不確定度

ur（Frep）=s1/ x=1.03×10-2。（A類不確定度）

3.2總偏差引入的不確定度分量ur（Frec）

5個(gè)樣品的添加回收率分別為82 %、85 %、90 %、91 %、80 %，平均回收率為85.6 %，標(biāo)準(zhǔn)偏差s為4.8 %。

標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

ur（Frec）=0.048/309.9=1.55×10-4。（A類不確定度）3.3樣品測試全過程引入的不確定度分量ur（B類不確定度）

3.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度ur（C）

3.3.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度ur1

3.3.1.2稱量產(chǎn)生的不確定度ur2

以減量法稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量0.2015 g。稱量使用萬分之一數(shù)字電子天平，計(jì)量證書標(biāo)明其線性為±0.15 mg，采用矩形分布，k=，天平的線性分量為：

減量法稱量過程天平使用2次，故稱量白藜蘆醇產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程量器產(chǎn)生的不確定度ur3

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中所用量器為：2個(gè)100 mL單標(biāo)線容量瓶、1個(gè)2 mL單標(biāo)線移液管。按照《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[13]，100 mL容量瓶的體積有3個(gè)主要影響因素：校準(zhǔn)、重復(fù)性和溫度。

（1）校準(zhǔn)：證書給出的容量瓶在20℃下的體積為100 mL±0.1 mL，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)假設(shè)為三角形分布：

（2）重復(fù)性：由于充滿容量瓶的變化引起的不確定度可通過該容量瓶的典型樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)來評估。對典型的100 mL容量瓶充滿10次并稱量的實(shí)驗(yàn)，得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02 mL，可直接用作標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

（3）溫度：根據(jù)證書提供的信息，該容量瓶已在20℃校準(zhǔn)，而實(shí)驗(yàn)室的溫度在±3℃之間變動。該影響引起的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來進(jìn)行計(jì)算。液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需考慮前者即可。乙醇的體積膨脹系數(shù)為0.75× 10-3/℃，因此產(chǎn)生的體積變化為：

±（100×3×0.75×10-3）=±0.225 mL。

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)假設(shè)溫度變化是矩形分布，即：

3種分量合成得到體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

對于2 mL單標(biāo)線移液管，只考慮由校準(zhǔn)引入的不確定度。證書給出的移液管在20℃下的體積為2 mL± 0.008 mL，按照矩形分布考慮，k=，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.1.4 10 μL進(jìn)樣針準(zhǔn)確度引入的不確定度ur4

3.3.1.5 HPLC儀器的準(zhǔn)確度引入的不確定度ur5

5種分量合成得到標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的不確定度ur(C)：

3.3.2樣品產(chǎn)生的不確定度ur(V)

3.3.2.1樣品制備過程量器產(chǎn)生的不確定度ur6

樣品制備過程中所用量器為：100 mL單標(biāo)線容量瓶、10 mL單標(biāo)線移液管。

100 mL容量瓶體積的3個(gè)影響因素產(chǎn)生的不確定度：

（2）重復(fù)性：0.02 mL；

（3）溫度：水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，因此產(chǎn)生的體積變化為：

±（100×3×2.1×10-4）=±0.063 mL。

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)假設(shè)溫度變化是矩形分布，即：

3種分量合成得到體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

對于10 mL單標(biāo)線移液管，只考慮由校準(zhǔn)引入的不確定度。證書給出的移液管在20℃下的體積為10 mL± 0.010 mL，按照矩形分布考慮，k=，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.2.2 10 μL進(jìn)樣針準(zhǔn)確度引入的不確定度u7

表2 標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表

證書給出的公差為±0.02 μL，按照矩形分布考慮，k=，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.2.3 HPLC儀器的準(zhǔn)確度引入的不確定度u8

由證書可知，σ＝0.0018 mg/kg，按照矩形分布考慮，k=，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3種分量合成得到標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的不確定度ur(V)：

3.3.3合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算（表2）

合成相對不確定度：

3.3.4擴(kuò)展不確定度通過使用包含因子k=2計(jì)算得出：

U95=1.09×10-2×2×309.9=6.76≈6.8 mg/L。

3.3.5不確定度報(bào)告

本次檢測葡萄酒中白藜蘆醇含量為：309.9 mg/L，U= 6.8 mg/L；k=2。

4　小結(jié)

本文評定了液相色譜法測定葡萄酒中白藜蘆醇含量的不確定度，通過評定可以初步得出如下結(jié)論：在評估白藜蘆醇測定方法的不確定度過程中，測量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液測定和樣品測定對不確定度的貢獻(xiàn)較大，其中測量重復(fù)性貢獻(xiàn)最大。深入分析可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液測定過程中主要的不確定度來源為：量器校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和進(jìn)樣針準(zhǔn)確度；樣品測定過程中主要的不確定度來源為：進(jìn)樣針準(zhǔn)確度。

因而在評定葡萄酒中白藜蘆醇含量不確定度過程中，應(yīng)主要考慮測量重復(fù)性引入的不確定度的影響，其次考慮量器校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和進(jìn)樣針等所引入的不確定度的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]魏志華,付潔.丁二酮肟重量法測定鎳量的不確定度評定[J].現(xiàn)代計(jì)量測試,2000(1)：53-58.

[2]魏莉萍,林景雪,馬月琴,等.差示掃描量熱法測量純度的不確定度分析[J].化學(xué)分析計(jì)量,2001(4)：4-7.

[3] General requirements for the competence of testing and calibration laboratories：ISO/IEC 17025:2005[S]. International Organization for Standardization, 2005.

[4]劉樹文,王華.葡萄與葡萄酒中白藜蘆醇的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),1999,19(5)：144-148.

[5] Siemann E H, Creasy L L. Concentration of the phytoalexin resveratrol in wine[J].Am J Enol Vitic,1992,43(1)：49-52.

[6] Lamuelas-Raventos R M, Waterhouse AL. Occurrence of resveratrol in selected California wines by a new HPLC method [J].JAgric Food Chem,1993,41(4)：79-85.

[7]韓雅珊,陳雷,戴蘊(yùn)青.高效液相色譜法測定葡萄酒中的白藜蘆醇[J].色譜,1999,17(4)：366-367.

[8]尉亞輝,劉興旺,李華.白藜蘆醇的研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,27(2)：188-195.

[9]王華,尉亞輝.葡萄酒中白藜蘆醇的HPLC測定[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999(4)：83-86.

[10]全國食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會釀酒分技術(shù)委員會.葡萄酒、果酒通用分析方法：GB/T 15038—2006 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[11]全國法制計(jì)量管理計(jì)量技術(shù)委員會.測量不確定度評定與表示：JJF 1059.1—2012 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2013.

[12]李慎安.測量不確定度表達(dá)百問[M].北京：中國計(jì)量出版社, 2001：110-115.

[13]中國合格評定國家認(rèn)可委員會.化學(xué)分析中不確定度的評估指南：CNAS—GL06[S].北京：中國合格評定國家認(rèn)可委員會,2006.

Evaluation of the Uncertainties in the Determination of Resveratrol Content in Grape Wine

WANG Yihua and SONG Jili
(China National Wine Quality Supervision and Inspection Center, Yantai, Shandong 264003, China)

Abstract:Based on JJF 1059.1-2012 and CNAS-GL06, the mathematical model had been developed for the determination of resveratrol content in grape wine by HPLC. The source of the uncertainties in the measurement was analyzed, and Type A and Type B uncertainties were assessed respectively. Each uncertainty component, combined standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated. The results showed that the uncertainty mainly came from gauge repeatability, calibration of volumetric apparatus, standard material purity and injection needle.

Key words:uncertainty; resveratrol; high performance liquid chromatography (HPLC); grape wine

作者簡介：王藝華(1981-),女,碩士,工程師,主要從事葡萄酒檢測工作。

收稿日期：2015-12-17

DOI：10.13746/j.njkj.2015470

中圖分類號：TS262.6；TS261.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）04-0102-04

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-02-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1734.005.html。