宋挺，朱冰川，嚴(yán)飛，徐超

(無錫市環(huán)境監(jiān)測中心站，江蘇 無錫 214121)

YSI6600V2水質(zhì)多參數(shù)儀現(xiàn)場快速法與實(shí)驗(yàn)室分光光度法測定湖泊藻類葉綠素的比較

宋挺，朱冰川，嚴(yán)飛，徐超

(無錫市環(huán)境監(jiān)測中心站，江蘇 無錫 214121)

通過將YSI6600V2水質(zhì)多參數(shù)儀測得的葉綠素a值與實(shí)驗(yàn)室分光光度法葉綠素a測定值進(jìn)行比較，分析了YSI6600V2多參數(shù)水質(zhì)監(jiān)測儀測定葉綠素a的準(zhǔn)確性與局限性。結(jié)果表明，YSI6600V2測定值多數(shù)偏低，且相關(guān)性較差。將YSI6600V2測得的藍(lán)藻密度樣本分為2類后，相關(guān)性得到顯著提升。提出了利用藍(lán)藻密度對樣本進(jìn)行分類后，分別進(jìn)行葉綠素a校正的方法，并說明了此種校正方法的局限性。

葉綠素；YSI6600V2水質(zhì)多參數(shù)儀；熒光法；局限性

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，內(nèi)陸湖泊水體富營養(yǎng)化越發(fā)嚴(yán)重，頻頻發(fā)生“水華”現(xiàn)象，使得對浮游植物的監(jiān)測成為研究的熱點(diǎn)[1]。

葉綠素是衡量水體初級生產(chǎn)力的重要指標(biāo)，對葉綠素進(jìn)行測定可以了解水體的生產(chǎn)力和富營養(yǎng)化水平，因此浮游藻類中的葉綠素是衡量水體富營養(yǎng)化的重要指標(biāo)[2]。浮游植物細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量隨浮游植物種類或類群而有所不同， 同時還受浮游植物年齡、生長率、光和營養(yǎng)條件的影響[3]。

通常，水樣中葉綠素的量可用來計算浮游植物的密度，而浮游植物的密度對于預(yù)測藻類的暴發(fā)和間接測量水體富營養(yǎng)化非常有幫助。葉綠素a的傳統(tǒng)測試方法——提取分析方法[4]，測試程序耗時長，需要有經(jīng)驗(yàn)的分析人員方能確保良好的數(shù)據(jù)及長期的一致性，且不能用于連續(xù)監(jiān)測[5]，無法獲得水華發(fā)生初期第一階段重要的實(shí)時數(shù)據(jù)。

為適應(yīng)夏季繁重的藍(lán)藻預(yù)警監(jiān)測任務(wù)，YSI多參數(shù)水質(zhì)監(jiān)測儀在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域被廣泛使用[6-10]，在對溶解氧、電導(dǎo)率、葉綠素a和藍(lán)藻密度等水質(zhì)項(xiàng)目的連續(xù)監(jiān)測方面，YSI比實(shí)驗(yàn)室常規(guī)監(jiān)測更優(yōu)越。

葉綠素?zé)晒馀c植物光合作用密切相關(guān)，研究表明，植物吸收的太陽輻射能量用于3個方面：光合作用中的光化學(xué)反應(yīng)、熱耗散和熒光[11]。這3者在植物生理上是密切關(guān)聯(lián)的，存在著近似此消彼長的關(guān)系，因此可以通過熒光更為直接地探測與植物光合作用相關(guān)的信息。

熒光的探測方法分為主動和被動2類，主動的方法包括熒光動力學(xué)技術(shù)和激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)?，F(xiàn)使用的YSI多參數(shù)水質(zhì)監(jiān)測儀的型號為YSI6600V2(以下簡稱YSI6600V2)，它對葉綠素a和藍(lán)藻使用的是激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)。

監(jiān)測葉綠素a時，用峰波長為 470 nm左右的藍(lán)光作為激發(fā)光源。用這種藍(lán)光照射時，在完整細(xì)胞中存在的葉綠素a將會發(fā)射出光譜在 650～700 nm 范圍內(nèi)的熒光。為了量化熒光信號，系統(tǒng)檢測器采用高靈敏度的光敏二極管，并且用光學(xué)濾光片限定檢測波長。濾光片阻止了被水樣中顆粒反射的470 nm的激發(fā)光被檢測到。

為驗(yàn)證YSI6600V2監(jiān)測葉綠素a濃度的準(zhǔn)確性，現(xiàn)就YSI6600V2檢測的葉綠素a數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法檢測的葉綠素a數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據(jù)無錫市環(huán)境監(jiān)測中心站對太湖梅梁湖水域的巡查路線，將采樣點(diǎn)分布于太湖梅梁湖水域，見圖1。于2010年1—11月期間，共采集313個樣品。

1.2 樣品分析

為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可比性，水樣采集后，倒入YSI6600V2儀器測量杯中測定葉綠素a和藍(lán)藻密度。測試完畢后，取一定體積的水樣進(jìn)行抽濾(根據(jù)樣品中葉綠素a含量決定)，將濾膜的水分吸干后對折，根據(jù)國家環(huán)境保護(hù)總局編制的《水和廢水監(jiān)測(第四版)》中葉綠素a的測定方法，對水樣的葉綠素a濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室測定。

1.3 方法間評估

現(xiàn)使用均方根偏差(root mean square error， RMSE)和平均絕對偏差(mean absolute percentage error， MAPE)來評價2種葉綠素a測量方法的結(jié)果，計算公式分別為：

(1)

(2)

式中：xiYSI——YSI6600V2方法測量的ρ(葉綠素a)經(jīng)模型反演換算后的值，mg/L；

xLab——實(shí)驗(yàn)室檢測的ρ(葉綠素a)，mg/L；

n——樣本數(shù)。

圖1 采樣點(diǎn)位分布

2 結(jié)果與討論

2.1 YSI6600V2與實(shí)驗(yàn)室測定葉綠素a結(jié)果比對

YSI6600V2與實(shí)驗(yàn)室測定葉綠素a濃度的結(jié)果如表1所示。其中，101組數(shù)據(jù)樣本YSI6600V2測定值比實(shí)驗(yàn)室方法測定值高，2組數(shù)據(jù)樣本測定值相同，210組數(shù)據(jù)樣本YSI6600V2測定值比實(shí)驗(yàn)室方法測定值低，說明YSI6600V2測定值較實(shí)驗(yàn)室方法多數(shù)偏低。

表1 2種方法測定葉綠素a結(jié)果的統(tǒng)計 μg/L

對2組數(shù)據(jù)做配對T檢驗(yàn)，在置信水平為95%時，顯著性水平為0.05，雙尾檢驗(yàn)概率p值為0.000，<0.05，拒絕零假設(shè)，表明2組數(shù)據(jù)有顯著性差異。對這2組數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析，得到?jīng)Q定系數(shù)為0.069，相關(guān)性較差，線性回歸見圖2。

由圖2可見，2組數(shù)據(jù)的相關(guān)性雖然較差，但樣本點(diǎn)分布集中在2個區(qū)間，即有著2組不同方向的趨勢。

圖2 YSI6600V2方法測定與實(shí)驗(yàn)室方法測定葉綠素a值線性回歸

針對每組樣品，還用YSI6600V2測量了藍(lán)藻密度， 根據(jù)測定藍(lán)藻密度的不同，分別以500，1 000，1 500和2 000萬L-1為界，將數(shù)據(jù)分為藍(lán)藻高密度樣本和藍(lán)藻低密度樣本2組，對YSI6600V2方法和實(shí)驗(yàn)室方法測定的葉綠素a值分別進(jìn)行回歸比較，結(jié)果如圖3(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)(h)和表2所示。

(a)500萬L-1臨界高密度組；(b) 500萬L-1臨界低密度組；(c) 1 000萬L-1臨界高密度組；(d)1 000萬L-1臨界低密度組；(e) 1 500萬L-1臨界高密度組；(f) 1 500萬L-1臨界低密度組；(g) 2 000萬L-1臨界高密度組；(h) 2 000萬L-1臨界低密度組。

圖3 分組后2種方法比對的線性回歸

表2 藍(lán)藻密度不同臨界值分組的2種方法比對結(jié)果

由圖3和表2可見，按照藍(lán)藻密度不同的臨界值將樣品分組后，2種方法均顯著相關(guān)，且相關(guān)性都得到了顯著的提高?，F(xiàn)取平均決定系數(shù)最高的藍(lán)藻密度為1 000萬L-1臨界值進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，當(dāng)YSI6600V2測得的藍(lán)藻密度>1 000萬L-1時，以YSI6600V2測量葉綠素a濃度為自變量，實(shí)驗(yàn)室方法測量葉綠素a濃度為應(yīng)變量，通過線性擬合，回歸方程如式(3)所示。2種方法葉綠素a值的決定系數(shù)為0.595 1，RMSE為0.050 5 mg/L，MAPE為74.45%。

y=8.991 3x+0.029 9

(3)

當(dāng)YSI6600V2測得的藍(lán)藻密度<1 000萬L-1時，以其測量葉綠素a濃度為自變量，實(shí)驗(yàn)室方法測量葉綠素a濃度為因變量，通過線性擬合，回歸方程如式(4)所示。2種方法葉綠素a濃度值的決定系數(shù)為0.697 3，RMSE為0.008 03mg/L，MAPE為28.53%。

y=0.826x+0.003 1

(4)

可以看出，根據(jù)藍(lán)藻密度對樣本進(jìn)行分組后，2類樣本的相關(guān)系數(shù)均顯著提升，其中藍(lán)藻低密度樣本組的相關(guān)性高于藍(lán)藻高密度樣本組；而YSI6600V2方法和實(shí)驗(yàn)室方法測定葉綠素a值的RMSE和MAPE，藍(lán)藻低密度樣品組也低于藍(lán)藻高密度樣品組。

2.2 比對結(jié)果原因分析

對YSI6600V2方法和實(shí)驗(yàn)室方法測定的葉綠素a值進(jìn)行線性回歸時，313組樣本雖然總體相關(guān)性較差，但是散點(diǎn)圖顯現(xiàn)出2組不同的集中分布區(qū)間。在利用藍(lán)藻密度將這313組樣本分為藍(lán)藻高密度樣本區(qū)和藍(lán)藻低密度樣本區(qū)后，2組樣本區(qū)的相關(guān)性均顯著得到了提升，其中藍(lán)藻高密度樣本區(qū)的偏差要高于藍(lán)藻低密度樣本區(qū)的偏差?，F(xiàn)通過YSI6600V2測定葉綠素和藍(lán)藻密度的原理，對這種現(xiàn)象進(jìn)行分析與解釋。

YSI6600V2測量葉綠素a濃度和藍(lán)藻密度，都是基于熒光的原理，其中葉綠素a濃度使用波長為470nm左右的藍(lán)光作為激發(fā)光，藍(lán)藻密度使用波長為600nm左右的橙黃光作為激發(fā)光。圖4是多激發(fā)波長調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMulti-Color-PAM原理說明中關(guān)于不同藻種在不同波長的激發(fā)光下產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的描述。

圖4 不同藻種在不同波長激發(fā)光下激發(fā)的熒光強(qiáng)度

通過圖4不同藻種激發(fā)光與熒光的關(guān)系，對YSI6600V2的工作原理進(jìn)行分析：YSI6600V2使用470nm的藍(lán)光作為激發(fā)光測定葉綠素a濃度，綠藻、隱藻和硅藻被激發(fā)的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)且峰值相近，而藍(lán)藻被激發(fā)的熒光強(qiáng)度相對于其他藻種極弱(1/10左右)。

YSI6600V2在使用同一激發(fā)光測定水體葉綠素a的情況下，被激發(fā)出的熒光強(qiáng)度隨著水體中藻類種群的不同有著較大的差異(特別是藍(lán)藻相對于其他藻種)。

在日常的水質(zhì)監(jiān)測中，YSI6600V2葉綠素a探頭在通常情況下使用羅丹明WT標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行統(tǒng)一校正，由于藍(lán)藻在470nm左右的藍(lán)光作為激發(fā)光的情況下，被激發(fā)的熒光強(qiáng)度與其他藻種的差異性，在使用統(tǒng)一校正標(biāo)準(zhǔn)的情況下，葉綠素a測定結(jié)果將不準(zhǔn)確，這也是造成YSI6600V2方法與實(shí)驗(yàn)室方法測定葉綠素a結(jié)果差異的主要原因。

2.3 對YSI6600V2葉綠素a系統(tǒng)的校正及局限性

YSI6600V2在使用同一激發(fā)光測定水體葉綠素a的情況下，被激發(fā)的熒光強(qiáng)度隨著水體中藻類種群結(jié)構(gòu)的不同有著較大的差異(特別是藍(lán)藻相對于其他藻種)。

YSI6600V2測定藍(lán)藻密度是基于藍(lán)藻特有的光合色素(藻藍(lán)素)的熒光原理，所以測定的藍(lán)藻密度相對準(zhǔn)確，而藍(lán)藻密度的高低，也在一定程度上反映了水體中的藻類種群構(gòu)成，即藍(lán)藻密度高的水體，藍(lán)藻為優(yōu)勢種的可能性較大；藍(lán)藻密度低的水體，綠藻、硅藻等其他藻種為優(yōu)勢種的可能性較大。上文根據(jù)藍(lán)藻密度將樣品進(jìn)行分類分析后，相關(guān)性均顯著提升，藍(lán)藻被激發(fā)的熒光強(qiáng)度與其他藻種的差異性，是造成在使用統(tǒng)一校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的情況下藍(lán)藻高密度樣本區(qū)的偏差要高于藍(lán)藻低密度樣本區(qū)的偏差的主要原因。

對YSI6600V2葉綠素a系統(tǒng)進(jìn)行校正，建議先根據(jù)YSI6600V2測得藍(lán)藻密度的不同(1 000萬L-1為界效果最好)，對樣本進(jìn)行分類，再對YSI6600V2方法與實(shí)驗(yàn)室方法測得的葉綠素a結(jié)果分別進(jìn)行回歸分析，將得到的2個回歸方程分別應(yīng)用到藍(lán)藻高密度樣本的葉綠素a校正與藍(lán)藻低密度樣本的葉綠素a校正。

在具體的水體樣本中，藻類的種群構(gòu)成不能簡單地以YSI6600V2測得的藍(lán)藻密度來區(qū)分，這需要實(shí)驗(yàn)室鏡檢的分析結(jié)果?，F(xiàn)根據(jù)藍(lán)藻密度來估算水體中優(yōu)勢種的構(gòu)成，從而對YSI6600V2方法測定的葉綠素a結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)只是大致估算，有著一定的局限性。

3 結(jié)論

(1) 通過對YSI6600V2和實(shí)驗(yàn)室分光光度法2種方法測定的葉綠素a值進(jìn)行回歸分析，YSI6600V2測定值多數(shù)偏低，相關(guān)性較差且不顯著。在利用YSI6600V2測得的藍(lán)藻密度將樣本分為2類后，相關(guān)性顯著且得到大幅度提升；

(2) 依據(jù)YSI6600V2測定葉綠素a和藍(lán)藻密度的熒光法原理，分析了熒光法測定葉綠素a和藍(lán)藻密度的生物光學(xué)機(jī)理和測定藍(lán)藻葉綠素a的局限性；

(3) 基于比對分析結(jié)果，以及熒光法測定葉綠素a和藍(lán)藻密度的原理，提出利用藍(lán)藻密度對樣本進(jìn)行分類后，再分別進(jìn)行葉綠素a的校正；

(4) 以藍(lán)藻密度來區(qū)分水體中藻類種群構(gòu)成，并依此對YSI6600V2測得的葉綠素a濃度進(jìn)行分組校正只是大致估算，還需要結(jié)合藻類鏡檢結(jié)果進(jìn)行精確分析與驗(yàn)證。

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欄目編輯 周立平

Comparison of Onsite YSI6600V2 Multi-Parameter Water Quality Meter and Laboratory Spectrophotometry for the Determination of Lake Algal Chlorophyll

SONG Ting， ZHU Bing-chuan， YAN Fei， XU Chao

(WuxiEnvironmentalMonitoringCenter，Wuxi，Jiangsu214121，China)

In this study， we compared the measured values of chlorophyll a by both YSI6600V2 multi-parameter water quality meter and laboratory spectrophotometry， and explored the accuracy and limitations of the measurement by the YSI6600V2 multi-parameter water quality monitor. The results showed that the majority of the measured values by YSI6600V2 was low and had poor correlation. After dividing the cyanobacteria samples into two categories according to their measured dentistry by YSI6600V2， the correlation was significantly improved. We proposed the use of a correction method for chlorophyll a measurement after classifying the cyanobacteria samples based on the density， and illustrated the limitations of this method.

Chlorophyll； YSI6600V2 multi-parameter water quality meter； Fluorescence method； Limitations

2015-08-07；

2016-03-17

江蘇省高校自然科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(14KJB170009)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程基金資助項(xiàng)目(164320H116)

宋挺(1982—)，男，工程師，本科，從事生物監(jiān)測和生態(tài)遙感監(jiān)測研究工作。

X835

B

1674-6732(2016)05-0014-05