閆 彬

(重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400044)

不同生長(zhǎng)速率下水華束絲藻儲(chǔ)磷能力研究

閆 彬

(重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400044)

對(duì)不同生長(zhǎng)速率的水華束絲藻體內(nèi)顆粒態(tài)聚合磷酸鹽含量進(jìn)行了分析，討論了藻種不同生長(zhǎng)階段對(duì)磷的儲(chǔ)存特點(diǎn)，促進(jìn)對(duì)藻類儲(chǔ)磷能力的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

水華束絲藻，生長(zhǎng)速率，聚合磷酸鹽

磷是浮游藻類細(xì)胞膜、核酸的主要組成元素，藻類的生長(zhǎng)與胞外磷濃度、胞內(nèi)磷濃度均有關(guān)，主要受胞內(nèi)濃度的影響。柵藻的批次培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)在胞外磷被耗盡的情況下，柵藻仍能維持指數(shù)生長(zhǎng)[1]。藻類對(duì)磷存在“奢侈吸收”(luxury absorption)現(xiàn)象[2]，并以聚合磷酸鹽(polyphosphate,以下簡(jiǎn)寫為“PolyP”)的形式儲(chǔ)存在體內(nèi)，用于維持外界磷匱乏時(shí)細(xì)胞對(duì)磷的需求。藻類對(duì)外部環(huán)境中不同形態(tài)磷酸鹽的吸收利用特點(diǎn)已有大量研究，然而藻細(xì)胞內(nèi)部磷儲(chǔ)存的研究相對(duì)較少。

本文以一種常見水華藻種——水華束絲藻為研究對(duì)象，通過恒化培養(yǎng)的方式來獲得處于不同生長(zhǎng)速率階段的藻種，避免了批次培養(yǎng)后期營(yíng)養(yǎng)物限制及半連續(xù)培養(yǎng)過程中穩(wěn)定期難以維持的問題[3,4]。討論處于不同生長(zhǎng)速率狀態(tài)的藻種對(duì)于磷的儲(chǔ)存特點(diǎn)，以期闡釋該水華藻種的磷策略。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)藻種為水華束絲藻(Aphanizomenon flos-aquae,FACHB-1029)，購于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。藻種培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)開展均在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照強(qiáng)度27 μmol/(m2·s)，光暗比為12 h∶12 h，培養(yǎng)基為BG-11[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

藻種在實(shí)驗(yàn)前先使用無磷的BG11培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)1周。藻種的培養(yǎng)分為間歇培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)階段：間歇培養(yǎng)即特定濃度的藻種(1.5×107cell/mL)在BG11培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期；連續(xù)培養(yǎng)則在間歇培養(yǎng)階段達(dá)到穩(wěn)定后對(duì)培養(yǎng)裝置進(jìn)行一定稀釋速率的稀釋，稀釋液為無菌BG11培養(yǎng)基。當(dāng)葉綠素濃度連續(xù)6 d的數(shù)值變化在±5%以內(nèi)時(shí)，認(rèn)為系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)系統(tǒng)的稀釋速率即為藻類的生長(zhǎng)速率[6]。藻種培養(yǎng)于1 L錐形瓶中，連續(xù)培養(yǎng)階段的培養(yǎng)體積為600 mL，稀釋速率分別為0.1 d-1,0.2 d-1,0.4 d-1,0.6 d-1,0.8 d-1。為保證藻細(xì)胞在培養(yǎng)裝置中的均勻分布，培養(yǎng)過程中均連續(xù)通入針頭過濾器(pore size:0.22 μm)過濾后的無菌空氣，同時(shí)提供藻類生長(zhǎng)需求的無機(jī)碳。

葉綠素濃度每天檢測(cè)，采樣時(shí)間為每天8:00。當(dāng)系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，測(cè)定細(xì)胞總磷、顆粒態(tài)聚合磷酸鹽含量，同時(shí)使用熒光顯微技術(shù)對(duì)藻類聚合磷酸鹽進(jìn)行定性分析。

1.3 測(cè)試方法

藻液的葉綠素濃度由葉綠素a代替，根據(jù)酒精冷凍提取法測(cè)定[7]。將藻液置于離心機(jī)(Eppendorf,5804R)中離心收集(6 500 rpm,10 min)藻細(xì)胞，蒸餾水離心清洗三次。向離心管中加入4 mL乙醇(95%)并使藻種重新混勻。將上述處理后的樣品放于4 ℃冰箱中提取12 h，離心收集上清液，然后使用紫外分光光度計(jì)在649 nm,665 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定溶液吸光度。

細(xì)胞總磷(Total Cellular Phosphorus,簡(jiǎn)寫為“TCP”)的測(cè)定參考總磷的測(cè)定方法[8]：藻細(xì)胞收集及清洗后，先用5%過硫酸鉀氧化(120 ℃,30 min)，冷卻至室溫后使用GF/F濾膜濾去雜質(zhì)，使用鉬銻抗分光光度法測(cè)定濾液中磷含量。文中各類磷酸鹽的含量均以P計(jì)。

顆粒態(tài)聚合磷酸鹽(Polyphosphate granules,簡(jiǎn)寫為“PolyP”)的測(cè)定使用熱水提取方法。將藻液置于離心機(jī)(Eppendorf,5804R)中離心收集(6500 rpm,10 min)藻細(xì)胞，蒸餾水離心清洗三次后轉(zhuǎn)移至50 mL比色管，蒸餾水定容至25 mL，使用配套的磨口塞封閉比色管，并在管口使用紗布包裹，將比色管放入高壓滅菌鍋中進(jìn)行提取(105 ℃,30 min)。待提取液冷卻至室溫后使用GF/F濾膜(Whatman)過濾并使用蒸餾水定容至50 mL。將濾液均分為兩份(a,b)，使用鉬銻抗分光光度法[8]在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定a份中的正磷酸鹽含量，即可提取正磷酸鹽(extracted Soluble reactive Phosphorus,簡(jiǎn)寫為“e-SRP”)。向b份中加入4 mL過硫酸鉀(5%)，密封后放入高壓滅菌鍋消解(120 ℃,30 min)，冷卻后按鉬銻抗分光光度法[8]測(cè)定消解后磷酸鹽含量，即為可提取的總磷酸鹽(total extractable cellular phosphorus,簡(jiǎn)寫為“e-TCP”)。e-TCP與 e-SRP的差值即為顆粒態(tài)PolyP的含量。

PolyP的熒光染色：細(xì)胞中PolyP能夠與DAPI結(jié)合后在紫外光激發(fā)下發(fā)出黃色熒光[9]。具體操作如下：取1 mL藻液，離心并蒸餾水清洗三次后(6 500 rpm,10 min)加入1 mL 2%戊二醛，固定10 min；離心后棄上清液，取10 μL固定后的藻液，然后加入10 μL DAPI試劑(DAPI濃度為50 mg/L)，染色10 min后以330 nm～385 nm紫外光作為激發(fā)光，在熒光顯微鏡(BX53FL+MP5.0,Olympus)下觀察PolyP染色情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻種培養(yǎng)過程

連續(xù)培養(yǎng)開始后，系統(tǒng)中生物量受到培養(yǎng)基稀釋和藻種生長(zhǎng)的共同作用，藻種隨著培養(yǎng)基的稀釋而被大量沖走的同時(shí)，新補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)藻種的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)所涉及的稀釋速率梯度中，系統(tǒng)中葉綠素濃度最終均能達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，即實(shí)現(xiàn)該生長(zhǎng)速率的長(zhǎng)時(shí)間維持。在不同生長(zhǎng)速率穩(wěn)定階段，裝置內(nèi)的葉綠素濃度隨稀釋速率的增加而降低(見圖1)，葉綠素濃度最大值和最小值為(8 233±217)μg/L(0.1 d-1)和(652±30)μg/L(0.8 d-1)。

2.2 不同生長(zhǎng)速率藻種PolyP的熒光顯微分析

除磷饑餓處理的藻種以外，其他藻種的DAPI熒光染色圖像均表現(xiàn)出黃色熒光(見圖2)。說明在培養(yǎng)過程中，藻類出現(xiàn)對(duì)磷的“奢侈吸收”并以PolyP的形式儲(chǔ)存在體內(nèi)。

2.3 不同生長(zhǎng)速率藻種PolyP的含量

水華束絲藻細(xì)胞內(nèi)顆粒態(tài)PolyP含量隨生長(zhǎng)速率的升高呈緩慢增高現(xiàn)象(見圖3)。在生長(zhǎng)速率為0.1 d-1,0.2 d-1,0.4 d-1,0.6 d-1時(shí)，水華束絲藻細(xì)胞內(nèi)顆粒態(tài)PolyP含量無明顯差異(P>0.05)，為(0.25±0.03)μgP/μgChl-a,(0.26±0.04)μgP/μgChl-a,(0.29±0.09)μgP/μgChl-a,(0.39±0.04)μgP/μgChl-a。在生長(zhǎng)速率為0.8 d-1時(shí)，顆粒態(tài)PolyP含量大幅增加并達(dá)到最大值，為(0.49±0.07)μgP/μgChl-a。低生長(zhǎng)速率階段穩(wěn)定期所存在的高生物量一方面加劇了藻種對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的競(jìng)爭(zhēng)。另一方面高濃度藻種自身造成的遮蔽效應(yīng)不利于PolyP的合成，Kanai等的研究表明在有光條件下，小球藻會(huì)快速吸收正磷酸鹽并將以PolyP的形式儲(chǔ)存；無光條件下，PolyP的合成則會(huì)減弱[10]。

藻細(xì)胞TCP含量隨生長(zhǎng)速率的提高而增加(見圖3)，顆粒態(tài)PolyP在TCP中的比例(顆粒態(tài)PolyP/TCP)隨著生長(zhǎng)速率的提高呈現(xiàn)出先降低再升高的現(xiàn)象(見圖3)，在生長(zhǎng)速率為0.6 d-1時(shí)達(dá)到最低值，為(37.33±3.63)%。

3 結(jié)語

恒化培養(yǎng)利于研究藻類在不同生長(zhǎng)階段的營(yíng)養(yǎng)物吸收特點(diǎn)。水華束絲藻對(duì)磷的吸收與細(xì)胞自身所處的生長(zhǎng)階段有關(guān)，胞內(nèi)顆粒態(tài)PolyP含量在高生長(zhǎng)速率時(shí)略高于低生長(zhǎng)速率，生長(zhǎng)速率為0.8 d-1時(shí)顆粒態(tài)PolyP含量是所有實(shí)驗(yàn)梯度中最高的，為(0.49±0.07)μgP/μgChl-a。隨著生長(zhǎng)速率的增加，細(xì)胞含磷量不斷增加，使得顆粒態(tài)PolyP在TCP中的比例(顆粒態(tài)PolyP/TCP)呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。在低生長(zhǎng)速率時(shí)，細(xì)胞內(nèi)磷含量以顆粒態(tài)PolyP為主(65%左右)。當(dāng)生長(zhǎng)速率為0.6 d-1時(shí)，藻細(xì)胞中顆粒態(tài)聚合磷酸鹽在細(xì)胞總磷中的比例最小，為(37.33±3.63)%。高生長(zhǎng)速率階段的快速新陳代謝不利于藻種對(duì)磷的儲(chǔ)存，在使用藻類處理高濃度含磷污水時(shí)需控制藻種的生長(zhǎng)速率在較低水平。

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Phosphorus storage capacity of Aphanizomenon flos-aquae living at different growth rates

Yan Bin

(UrbanConstructionandEnvironmentalEngineeringCollege,ChongqingUniversity,Chongqing400044,China)

The polyphosphate granules content in Aphanizomenon flos-aquae living at several growth rates were detected. Characters of phosphorus storage in algae were discussed. It made a further understanding on algae’s phosphorus storage capacity.

Aphanizomenon flos-aquae, growth rate, polyphosphate

2015-04-02

閆 彬(1989- )，男，在讀碩士

1009-6825(2015)17-0194-02

X131

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