朱樹(shù)峰，于茵，胡洪營(yíng),2*

1. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院環(huán)境模擬與污染控制國(guó)家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2. 清華大學(xué)深圳研究生院國(guó)家環(huán)境保護(hù)環(huán)境微生物利用與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055；3. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院水環(huán)境系統(tǒng)工程研究室，北京 100012

隨著能源危機(jī)的日益嚴(yán)重，微藻生物柴油作為新型可再生能源（Vasudevan和Briggs, 2008）引起了國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。同時(shí)，微藻在污水深度脫氮除磷方面也具有明顯的優(yōu)勢(shì)。Oswald等（Oswald等, 1957; Gonzalez等, 1997; Mallick, 2002）于1958年提出利用微藻處理污水的概念后，作為污水三級(jí)處理的微藻深度脫氮除磷也得到了較快的發(fā)展?；谖⒃迥軌蛲瑫r(shí)應(yīng)用于污水脫氮除磷和生物能源生產(chǎn)的事實(shí)，胡洪營(yíng)等（胡洪營(yíng)等, 2009; Hu等, 2010;Hu等, 2011）提出了“污水深度脫氮除磷與微藻生物能源生產(chǎn)耦合工藝”。該工藝可凈化水質(zhì)并同時(shí)回收氮磷、獲得高價(jià)值藻細(xì)胞生物質(zhì)。然而，要實(shí)現(xiàn)上述工藝從實(shí)驗(yàn)室研究到大規(guī)模應(yīng)用，能源微藻在城市污水二級(jí)出水中的生長(zhǎng)速率較慢及生物質(zhì)產(chǎn)率較低是限制性因素之一。

關(guān)于提高微藻生產(chǎn)效率的方法，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量的研究，根據(jù)對(duì)應(yīng)工序的不同可分為藻種選擇、藻類培養(yǎng)兩類。藻種選擇方法是通過(guò)技術(shù)手段獲得高產(chǎn)率的微藻藻株，主要技術(shù)包括開(kāi)發(fā)快速篩選方法篩選大量藻種、研究生物質(zhì)及油脂代謝機(jī)理和利用遺傳學(xué)工具改性微藻（Ferrell和Valerie, 2008）但是有研究表明大量已選出的單一藻種培養(yǎng)不適于污水體系，污水體系里的雜藻、原生動(dòng)物等能夠降低單一藻種的生產(chǎn)效率甚至使培養(yǎng)系統(tǒng)崩潰（Cheng等, 2004; Hoffman等, 2008）。藻類培養(yǎng)方法是通過(guò)改變培養(yǎng)條件提高微藻的生產(chǎn)效率，溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽等培養(yǎng)條件的改變雖然提高生產(chǎn)效率效果明顯，但控制培養(yǎng)條件成本高且易于產(chǎn)生二次污染，不適合大規(guī)模應(yīng)用于污水體系。

混合培養(yǎng)是在培養(yǎng)系統(tǒng)中，對(duì)2種及2種以上的高產(chǎn)率微藻進(jìn)行培養(yǎng)以獲得生物質(zhì)的技術(shù)。許多研究報(bào)道，混合培養(yǎng)對(duì)微藻的生物質(zhì)產(chǎn)量具有促進(jìn)作用。對(duì)三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum、杜氏鹽藻Dunaliella salina和亞心形扁藻Platymanas subcordiformis3種海洋經(jīng)濟(jì)微藻在滅菌人工培養(yǎng)基條件下兩兩混合培養(yǎng)，在適合的接種比例下能夠促進(jìn)微藻生長(zhǎng)、增加生物量（黃偉偉, 2009）。海洋原甲藻Phaeodactylum tricornutumBohl與三角褐指藻Phaeodactylum tricornutumBohlin進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)三角褐指藻的生長(zhǎng)速率與生物質(zhì)產(chǎn)量均高于單一藻種培養(yǎng)（周成旭等，2006）。Johnsond等（Johnson和Admassu, 2013）的研究表明，在人工培養(yǎng)基條件下，4種微藻組成的混合藻種生物質(zhì)產(chǎn)量高于部分單一藻種培養(yǎng)的微藻。混合微藻通過(guò)細(xì)胞接觸（Twirler, 2001）、化感作用（Floeder等, 2006）和生長(zhǎng)資源競(jìng)爭(zhēng)（Kuwata和Miyazaki, 2000）等機(jī)制相互影響，主要有促進(jìn)、中性和抑制4種關(guān)系。影響機(jī)制受藻種的影響，選擇合適的微藻進(jìn)行混合培養(yǎng)能夠有效提高生物質(zhì)產(chǎn)率。此外，混合培養(yǎng)將適宜條件各異的高產(chǎn)率藻種混合，可以擴(kuò)大培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)條件控制范圍，從而降低培養(yǎng)系統(tǒng)的維護(hù)成本。大規(guī)模微藻混合培養(yǎng)系統(tǒng)抵御環(huán)境條件（溫度、捕食者等）突變的能力也更強(qiáng)。因此，微藻混合培養(yǎng)的研究對(duì)生物質(zhì)生產(chǎn)具有重要的意義。目前關(guān)于微藻混合培養(yǎng)的研究多集中于水華微藻生長(zhǎng)抑制及人工培養(yǎng)基條件下常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)微藻生物質(zhì)生產(chǎn)，而關(guān)于污水條件下混合培養(yǎng)對(duì)能源微藻生長(zhǎng)特性影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究選取3株典型的高含油脂藻：柵藻LX1（Scenedesmussp. LX1）、橢圓小球藻YJ1（Chlorella ellipsoideaYJ1）和雨生紅球藻（Haematococcus pluvislis），對(duì)比研究3株微藻單一藻種、兩兩混合藻種條件下的生長(zhǎng)特性，以篩選出能夠有效促進(jìn)城市污水二級(jí)出水條件下微藻生物質(zhì)生產(chǎn)的混合藻種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水樣

生活污水二級(jí)出水（以下簡(jiǎn)稱“二級(jí)出水”），取自北京G污水處理廠的二沉池出水。水樣先經(jīng)過(guò)0.45 μm的濾膜過(guò)濾（濾后二級(jí)出水的水質(zhì)為：pH=7.87，ρ(TN)=26.8 mg·L-1，ρ(TP)=0.03 mg·L-1），再經(jīng)高溫高壓滅菌（121 ℃，20 min）后用于藻類培養(yǎng)。

1.1.2 藻種

柵藻LX1（Li等, 2010a）由李鑫等從低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中分離獲得，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為No.3036。橢圓小球藻YJ1由楊佳（Yang等, 2011）分離自城市生活污水二級(jí)出水，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為No.3037。雨生紅球藻由中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)（武漢）提供，其編號(hào)為FACHB-712。所選3株藻種均能夠在污水條件下快速生長(zhǎng)并積累油脂。3種微藻均采用mBG11培養(yǎng)基（Li等, 2010b），試驗(yàn)前，將各個(gè)藻種置于人工氣候箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)條件：25 ℃，光照強(qiáng)度40～60 Lux，相對(duì)濕度75%，光暗比14 h:10 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藻類生長(zhǎng)特性研究

利用滅菌二級(jí)出水對(duì)3種試驗(yàn)藻種分別進(jìn)行單一藻種和兩兩混合藻種的培養(yǎng)。向500 mL錐形瓶中加入200 mL試驗(yàn)水樣待用?？刂泼科砍跏冀臃N藻細(xì)胞總干物質(zhì)量濃度均為7 μg/L，按照不同藻種組合計(jì)算所需藻液量進(jìn)行接種，不同藻種組合中藻細(xì)胞數(shù)目比及藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度比見(jiàn)表1。接種完成后，將所有培養(yǎng)瓶中已滅菌的試驗(yàn)水樣均補(bǔ)充到220 mL。錐形瓶置于光照強(qiáng)度1 400 Lux，光暗比14 h:10 h、25 ℃的人工氣候箱中培養(yǎng)。每組試驗(yàn)做3個(gè)平行樣。

采用顯微鏡血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，換算得到培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞密度。配制不同質(zhì)量濃度梯度的藻液，利用血球計(jì)數(shù)板法在顯微鏡下測(cè)定不同質(zhì)量濃度梯度的藻液的藻密度，并利用SS測(cè)定方法測(cè)定藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度質(zhì)量濃度，做藻密度與干物質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 不同藻種組合初始接種藻細(xì)胞數(shù)目比及藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度比Table 1 The initial cell density ration and biomass ratio of different microalgae species

表2 藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度與藻密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 The standard line between the biomass and cell density of three microalgae

1.2.2 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定均采用國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法，TN、TP 和NH4+-N的測(cè)定方法分別為過(guò)硫酸鉀氧化紫外分光光度法、鉬酸銨分光光度法和納氏試劑分光光度法（國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局, 2002）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

Logistic 模型是描述有限環(huán)境下種群生物量增長(zhǎng)的經(jīng)典模型（種云霄, 2005），藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度是表征種群生長(zhǎng)量的重要參數(shù)，因此利用Logistic模型描述藻細(xì)胞的干物質(zhì)量濃度增長(zhǎng)規(guī)律：

式中，Gt為t時(shí)刻的干物質(zhì)量濃度質(zhì)量濃度，單位為mg·L-1；t為培養(yǎng)時(shí)間，單位為d；Gmax為最大干物質(zhì)量濃度質(zhì)量濃度，單位為mg·L-1；a為常數(shù)，表示曲線對(duì)原點(diǎn)的相對(duì)位置；r為種群的內(nèi)稟增長(zhǎng)速率，單位為d-1，指單個(gè)個(gè)體潛在的最大增長(zhǎng)速率；dG/dt為種群生物量增長(zhǎng)速率，單位為mg·(L·d)-1。

式（1）表示種群生物量隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線，具“S”型特征。式（2）表示生物量增長(zhǎng)速率隨密度變化的規(guī)律。

藻細(xì)胞在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的比生長(zhǎng)速率可通過(guò)式（3）進(jìn)行計(jì)算。

式中，μ為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的比生長(zhǎng)速率，單位為d-1，t1和t2為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的開(kāi)始和結(jié)束時(shí)間，單位為d，G1和G2為t1和t2時(shí)刻對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞密度，單位為mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 柵藻LX1和橢圓小球藻YJ1混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性

柵藻LX1和橢圓小球藻YJ1在滅菌污水條件下，混合藻種及單一藻種（對(duì)照組）培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線如圖1。柵藻LX1和橢圓小球藻YJ1單一藻種培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線均符合“S”型曲線，接種后前2 d均為遲滯期，從第2天開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)較快的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，柵藻LX1第8天進(jìn)入穩(wěn)定期，橢圓小球藻YJ1第7天進(jìn)入穩(wěn)定期。對(duì)照組橢圓小球藻YJ1生長(zhǎng)初期藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度質(zhì)量濃度下降，但自第3天起藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度質(zhì)量濃度上升并逐漸接近柵藻LX1，最終柵藻LX1與橢圓小球藻藻細(xì)胞。這表明，橢圓小球藻 YJ1適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境能力較差，但能逐漸恢復(fù)并且恢復(fù)后的生長(zhǎng)能力與柵藻 LX1無(wú)明顯區(qū)別。

圖1 柵藻LX1與橢圓小球藻YJ1混合藻種與單一藻種培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of Scenedesmus sp. LX1 and Chlorella ellipsoidea YJ1 under mono-culture and mixed culture conditions

混合藻種培養(yǎng)條件下，2種微藻進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間與對(duì)照組相同，柵藻LX1仍在第8天進(jìn)入穩(wěn)定期，橢圓小球藻YJ1比對(duì)照組提前1 d進(jìn)入穩(wěn)定期。橢圓小球藻YJ1的藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度質(zhì)量濃度經(jīng)歷初期的急速降低后開(kāi)始增長(zhǎng)，但一直低于柵藻LX1；同時(shí)柵藻LX1生長(zhǎng)曲線尾部表現(xiàn)出更高的增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明在混合培養(yǎng)條件下柵藻LX1生長(zhǎng)能力強(qiáng)于橢圓小球藻YJ1。顯微鏡下觀察結(jié)果表明，混合藻種培養(yǎng)中柵藻LX1與橢圓小球藻YJ1藻細(xì)胞的大小形態(tài)與對(duì)照組相比無(wú)明顯區(qū)別。

2.2 橢圓小球藻 YJ1和雨生紅球藻混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性

圖2 橢圓小球藻YJ1與雨生紅球藻混合藻種與單一藻種培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig. 2 Growth curves of Chlorella ellipsoidea YJ1 and Haematococcus pluvialis under mono-culture and mixed culture conditions

橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻在滅菌污水條件下混合藻種及單一藻種（對(duì)照組）培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。單一藻種培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線均符合“S”型曲線，橢圓小球藻YJ1接種后前2 d為遲滯期，從第2天開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)較快的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；雨生紅球藻無(wú)明顯遲滯期、直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，兩者均在第8天左右進(jìn)入穩(wěn)定期。對(duì)照組橢圓小球藻YJ1生長(zhǎng)初期藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度下降，且自第1天起藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度一直低于雨生紅球藻，表明單一藻種培養(yǎng)條件下雨生紅球藻生長(zhǎng)能力強(qiáng)于橢圓小球藻YJ1。

混合藻種培養(yǎng)條件下，2種微藻進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間與對(duì)照組相同，雨生紅球藻仍第8天進(jìn)入穩(wěn)定器，橢圓小球藻YJ1比對(duì)照組提前3天進(jìn)入穩(wěn)定期。雨生紅球藻自第1天起藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度一直高于橢圓小球藻YJ1，表明混合培養(yǎng)條件下雨生紅球藻生長(zhǎng)能力強(qiáng)于橢圓小球藻YJ1。顯微鏡下觀察結(jié)果表明，混合藻種培養(yǎng)中橢圓小球藻YJ1與雨生紅球藻藻細(xì)胞的大小形態(tài)與對(duì)照組相比無(wú)明顯區(qū)別。

2.3 柵藻LX1和雨生紅球藻混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性

柵藻 LX1和雨生紅球藻在滅菌污水條件下混合藻種及單一藻種（對(duì)照組）培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。柵藻LX1和雨生紅球藻單一藻種培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線均符合“S”型曲線，柵藻LX1前2 d天均為遲滯期，從第2天開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)較快的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，雨生紅球藻無(wú)明顯遲滯期、直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，兩者均在第8天左右進(jìn)入穩(wěn)定期。對(duì)照組雨生紅球藻自第 1天起藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度高于柵藻LX1，表明單一藻種培養(yǎng)條件下雨生紅球藻生長(zhǎng)能力強(qiáng)于柵藻LX1。

圖3 柵藻LX1與雨生紅球藻混合藻種與單一藻種培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig. 3 Growth curves of Scenedesmus sp. LX1 and Haematococcus pluvialis under mono-culture and mixed culture conditions

混合藻種培養(yǎng)條件下，柵藻LX1與雨生紅球藻從第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，柵藻LX1第8天左右進(jìn)入穩(wěn)定期，雨生紅球藻第12天才進(jìn)入穩(wěn)定期，混合藻種培養(yǎng)條件下雨生紅球藻的生長(zhǎng)受到促進(jìn)。柵藻LX1與雨生紅球藻的藻細(xì)胞干物質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化，第2～10天柵藻LX1高于雨生紅球藻，第10天之后雨生紅球藻高于柵藻 LX1。雨生紅球藻生長(zhǎng)曲線尾部增長(zhǎng)趨勢(shì)高于柵藻 LX1，表明混合培養(yǎng)條件下雨生紅球藻生長(zhǎng)能力強(qiáng)于柵藻 LX1。顯微鏡下觀察結(jié)果表明，混合藻種培養(yǎng)中柵藻LX1與雨生紅球藻藻細(xì)胞的大小形態(tài)與對(duì)照組相比無(wú)明顯區(qū)別。

表3 混合藻種培養(yǎng)與單一藻種培養(yǎng)微藻內(nèi)稟增長(zhǎng)速率比較1Table 3 The comparison between the intrinsic growth rate of microalgae under mixed cultures and mono-cultures

2.4 混合藻種培養(yǎng)與單一藻種培養(yǎng)生長(zhǎng)特性參數(shù)比較

利用Logistic模型得出的3株藻在不同藻種組合條件下的生長(zhǎng)特征參數(shù)見(jiàn)表 3，可以看出：柵藻LX1與橢圓小球藻YJ1混合培養(yǎng)的內(nèi)稟增長(zhǎng)速率分別高于其單一藻種培養(yǎng)。柵藻LX1與雨生紅球藻混合培養(yǎng)的內(nèi)稟增長(zhǎng)速率也分別高于其單一藻種培養(yǎng)。雨生紅球藻與橢圓小球藻YJ1混合培養(yǎng)時(shí)，雨生紅球藻的內(nèi)稟增長(zhǎng)速率低于其單一藻種培養(yǎng)，橢圓小球藻YJ1的內(nèi)稟增長(zhǎng)速率高于其單一藻種培養(yǎng)。柵藻LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻的最高內(nèi)稟增長(zhǎng)速率分別為1.73、1.31、0.97 d-1，分別在柵藻LX1+雨生紅球藻、雨生紅球藻+橢圓小球藻YJ1、柵藻LX1+雨生紅球藻混合培養(yǎng)組合中達(dá)到。

3株微藻在不同的藻種組合（單一培養(yǎng)及混合培養(yǎng)）條件下的比生長(zhǎng)速率見(jiàn)圖4。柵藻LX1與橢圓小球藻YJ1混合培養(yǎng)時(shí)，柵藻LX1和橢圓小球藻YJ1的比生長(zhǎng)速率分別為0.60、0.84 d-1，分別比柵藻LX1和橢圓小球藻YJ1的單一藻種培養(yǎng)提高了38%和11%。橢圓小球藻YJ1與雨生紅球藻混合培養(yǎng)時(shí)，橢圓小球藻YJ1的比生長(zhǎng)速率（0.71 d-1）低于其單一藻種培養(yǎng)，而雨生紅球藻的比生長(zhǎng)速率（0.45 d-1）比其單一藻種培養(yǎng)增加了16%。柵藻LX1與雨生紅球藻混合培養(yǎng)時(shí)，柵藻LX1和雨生紅球藻的比生長(zhǎng)速率分別為0.59、0.42 d-1，分別比柵藻LX1和雨生紅球藻的單一藻種培養(yǎng)提高了36%和9.0%。

圖4 3種微藻在不同藻種組合中的比生長(zhǎng)速率Fig. 4 The specific growth rate of three microalgae under mono-culture and mixed culture conditions

藻細(xì)胞的內(nèi)稟增長(zhǎng)速率是指種群在不受環(huán)境條件限制下的最大增長(zhǎng)率。不受環(huán)境條件限制指排除一切不利因素，提供理想的食物條件，給予最大的空間，排除捕食者和疾病的威脅等。因此內(nèi)稟增長(zhǎng)速率也叫生物潛能，表示種群的理想增殖潛力（李博, 2000）。范婧等（2012）的研究結(jié)果表明小球 藻Chlorella vulgaris-FACHB-31、斜生 柵 藻Scenedesmus obliquus-FACHB-416、魚(yú)腥藻Anabaena flos-aquae-FACHB-245、針桿藻Synefra acus-FACHB-1131混合培養(yǎng)中，4種藻的內(nèi)稟增長(zhǎng)速率均低于單一藻種培養(yǎng)，與本研究結(jié)果并不相同。顧啟華等（2007）等研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥藻能夠分泌有毒物質(zhì)抑制其他藻類的生長(zhǎng)，這與范婧等的研究結(jié)果相吻合。Uchida等（1999）發(fā)現(xiàn)米氏裸甲藻Gymnodinium mikimotoi在與環(huán)狀異甲藻Heterocapsa circularisquama混合培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)會(huì)逐漸被抑制直至死亡，作用機(jī)制可能為細(xì)胞直接接觸。張東鵬等（2000）發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)中亞歷山大藻Alexandrium catenella和錐狀施克里普藻Scrippsiella trochoidea能夠促進(jìn)擬菱形藻Pseudonitzschiasp.的生長(zhǎng)。由此表明，混合培養(yǎng)對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響隨藻種不同具有明顯的藻種特異性。柵藻LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻在二級(jí)出水條件下能夠通過(guò)混合培養(yǎng)獲得更高生產(chǎn)潛力。柵藻LX1與雨生紅球藻均在柵藻LX1+雨生紅球藻的混合培養(yǎng)組合中獲得最高的生長(zhǎng)潛力，橢圓小球藻YJ1與雨生紅球藻混合培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)潛力最高。

藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率是表征微藻的實(shí)際生長(zhǎng)速率，由藻細(xì)胞實(shí)際的生理活動(dòng)決定。本研究條件下，柵藻LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻在兩兩混合培養(yǎng)中獲得高于單一藻種培養(yǎng)的比生長(zhǎng)速率。Qian等（2008）研究報(bào)道，蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa在與銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa混合培養(yǎng)條件下，能夠更多地?cái)z取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)磷以獲取競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。柵藻 LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻可能為獲得兩兩種間競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，過(guò)量攝取營(yíng)養(yǎng)鹽能夠有效促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率。混合培養(yǎng)組合中3種微藻的比生長(zhǎng)速率分別低于對(duì)應(yīng)的內(nèi)稟生長(zhǎng)速率，可能原因是生長(zhǎng)環(huán)境如溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度等并未達(dá)到微藻發(fā)揮最大生殖潛力的適宜條件。陳家長(zhǎng)等（2010）的研究結(jié)果表明溫度是影響銅綠微囊藻和巨顫藻（Oscillatoria princeps）混合培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。陳德輝等（2000）報(bào)道營(yíng)養(yǎng)鹽磷和光照是影響銅綠微囊藻與斜生柵藻Scenedesmus obliquus混合培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)的重要因子。除了環(huán)境條件，微藻初始接種密度也會(huì)影響混合培養(yǎng)中微藻的競(jìng)爭(zhēng)與生長(zhǎng)（陳潔等, 2003）。通過(guò)調(diào)整光照、營(yíng)養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度和溫度等環(huán)境條件及初始接種密度，可以更充分地發(fā)揮柵藻LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻兩兩混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)潛力。

2.5 混合藻種培養(yǎng)與單一藻種培養(yǎng)生物質(zhì)產(chǎn)量比較

圖5 不同藻種組合（單一藻種及混合藻種）的生物質(zhì)產(chǎn)量Fig. 5 The biomass productivity of the mono-culture and mixed culture of three microalgae

3種微藻在兩兩混合培養(yǎng)及單一藻種培養(yǎng)條件下的最大生物質(zhì)產(chǎn)量見(jiàn)圖5。柵藻LX1與橢圓小球藻YJ1混合培養(yǎng)的生物質(zhì)產(chǎn)量為183 mg·L-1，分別比柵藻LX1和橢圓小球藻單一藻種培養(yǎng)提高了8%、48%。雨生紅球藻與橢圓小球藻YJ1混合培養(yǎng)的生物質(zhì)產(chǎn)量為204 mg·L-1，分別比雨生紅球藻、橢圓小球藻YJ1單一藻種培養(yǎng)提高了65%、4%。柵藻LX1與雨生紅球藻混合培養(yǎng)的生物質(zhì)產(chǎn)量為 277 mg·L-1，分別比柵藻LX1、雨生紅球藻單一藻種培養(yǎng)提高了64%、42%。滅菌二級(jí)出水培養(yǎng)條件下，與柵藻LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻的單一藻種相比，兩兩藻種混合的混合培養(yǎng)能夠促進(jìn)生物質(zhì)生產(chǎn)。柵藻LX1與雨生紅球藻的混合藻種，在二級(jí)出水培養(yǎng)條件下的生物質(zhì)生產(chǎn)潛力最高。

Cardinale（2011）等報(bào)道，天然水體中多種微藻混合培養(yǎng)能夠充分利用環(huán)境中的生長(zhǎng)資源，從而獲得更高的生物質(zhì)產(chǎn)量。羅飛（2009）研究發(fā)現(xiàn)，雨生血球藻CG-16株和CG-11株的株間混合培養(yǎng)生物質(zhì)產(chǎn)量顯著高于各自的單一藻種培養(yǎng)。蔡卓平等（2008）的研究結(jié)果表明，與單一藻種培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)可以促進(jìn)杜氏鹽藻和亞心形扁藻的生物質(zhì)產(chǎn)量。二級(jí)出水培養(yǎng)條件下柵藻LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻兩兩混合培養(yǎng)對(duì)生物質(zhì)積累的促進(jìn)作用與以上研究結(jié)果一致。但是，在Phatarpekar（2000）等的研究中發(fā)現(xiàn)，等鞭金藻Chaetoceros calcitran和角毛藻Isochrysis galbana混合培養(yǎng)的生物質(zhì)產(chǎn)量，低于 2種微藻的單一藻種培養(yǎng)。因此，混合培養(yǎng)對(duì)微藻生物質(zhì)產(chǎn)量的促進(jìn)作用同對(duì)生長(zhǎng)參數(shù)的促進(jìn)作用一樣具有藻種特異性?；旌吓囵B(yǎng)能夠促進(jìn)微藻群體生物質(zhì)產(chǎn)量的原因可能有3個(gè)：一是單一藻種培養(yǎng)中單一藻種的高度一致性可能導(dǎo)致激烈的種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)，從而影響群體生物質(zhì)的積累；二是混合培養(yǎng)中的微藻釋放出能夠促進(jìn)另一種微藻生物質(zhì)積累的化感物質(zhì)，改變其生長(zhǎng)液的環(huán)境，進(jìn)而影響群體的生物質(zhì)積累；三是不同微藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的需求形成互補(bǔ)關(guān)系，混合藻種能夠提高微藻對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)鹽資源的利用程度。

3 結(jié)論

（1）柵藻LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻3種能源微藻的兩兩藻種混合培養(yǎng)均能在二級(jí)出水條件下正常生長(zhǎng)，混合培養(yǎng)條件下雨生紅球藻的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)性強(qiáng)于柵藻LX1和橢圓小球藻YJ1。

（2）兩兩藻種混合培養(yǎng)能夠提高柵藻LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻的理想增殖潛力（內(nèi)稟增長(zhǎng)速率）與實(shí)際生長(zhǎng)速率（比生長(zhǎng)速率）。

（3）柵藻LX1、橢圓小球藻YJ1和雨生紅球藻3種能源微藻的兩兩藻種混合培養(yǎng)促進(jìn)了生物質(zhì)生產(chǎn)。

（4）柵藻 LX1+雨生紅球藻混合藻種的生物質(zhì)產(chǎn)量（277 mg·L-1）最高，分別比柵藻LX1、雨生紅球藻單一藻種培養(yǎng)提高了64%和42%。

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