黎小東，梁景耀，畢　超，李　平，梁艷華，林路洋，王煥麗，張錫寶，曹文苓

(廣州市皮膚病防治所檢驗科，廣東廣州 510095)

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·論著·

廣州地區(qū)淋球菌耐藥性的趨勢分析

黎小東，梁景耀，畢超，李平，梁艷華，林路洋，王煥麗，張錫寶，曹文苓△

(廣州市皮膚病防治所檢驗科，廣東廣州 510095)

摘要:目的了解廣州地區(qū)13年的產(chǎn)青霉素酶淋球菌(PPNG)和高水平耐四環(huán)素淋球菌(TRNG)的流行狀況及對5種抗菌藥物的耐藥趨勢。方法用瓊脂稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)以及用紙片碘量法檢測β-內(nèi)酰胺酶。結(jié)果1 324株淋球菌中，2000～2005年度PPNG檢出率占23.5%(156/665)，2008～2014年度PPNG檢出率占36.4%(240/659)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2000～2005年度TRNG檢出率占33.4%(222/665)，2008～2014年度TRNG檢出率占42.6%(281/659)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。青霉素耐藥率從71.1%(473/665)升高至87.1%(574/659)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；環(huán)丙沙星耐藥率由88.9%(591/665)升至98.0%(646/659)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；頭孢曲松中度敏感率從12.3%(82/665)提升到21.5%(142/659)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大觀霉素未發(fā)現(xiàn)耐藥菌。結(jié)論持續(xù)進(jìn)行淋球菌耐藥性監(jiān)測非常重要，大觀霉素在臨床上可以作為治療淋病的優(yōu)選藥物，具有良好療效。

關(guān)鍵詞:淋球菌；最低抑菌濃度；耐藥性

隨著國內(nèi)抗菌藥物的大量使用和時間的推移，淋球菌對抗菌藥物的耐藥性也有所不同。本所統(tǒng)一采用了世界衛(wèi)生組織(WHO)西太區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測規(guī)劃推薦的瓊脂稀釋法和藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行監(jiān)測[1-2]。

1材料與方法

1.1菌株來源本所從性病門診患者的泌尿生殖道分泌物中分離得到1 324 株淋球菌，其中2000～2005年665株，2008～2014年659株，所有菌株經(jīng)革蘭染色、氧化酶試驗和糖發(fā)酵試驗證實后，傳代一次后洗于脫脂牛奶中，于-78 ℃低溫冰箱凍存?zhèn)溆??？咕幬铮呵嗝顾?、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、頭孢曲松和大觀霉素由中國疾病預(yù)防中心性病控制中心提供。培養(yǎng)基：淋球菌(GC)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(OXOID 公司生產(chǎn))加入10%脫纖維新鮮羊血。標(biāo)準(zhǔn)菌株：WHO標(biāo)準(zhǔn)淋球菌菌株A、B、C、D、E由中國疾病預(yù)防中心性病控制中心提供。

1.2方法

1.2.1菌懸液制備實驗菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株用巧克力平板培養(yǎng)18～24 h 的淋球菌菌苔，用生理鹽水制成107CFU/mL的菌懸液。

1.2.2最低抑菌濃度(MIC)測定采用WHO 西太區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測規(guī)劃推薦的瓊脂稀釋法，具體如下。(1)先將5種抗菌藥物按要求配成原液，再倍比稀釋成不同的濃度。青霉素和環(huán)丙沙星是0.008～16 μg/mL 12個濃度；四環(huán)素16、8 μg/mL兩個濃度；頭孢曲松0.002～1 μg/mL 10個濃度；大觀霉素2～128 μg/mL 7個濃度。(2)將3.7%GC基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌，水浴冷卻至50 ℃，加入脫纖維新鮮羊血(終濃度10%)。取0.2 mL倍比稀釋好的5種抗菌藥物工作液，加入20 mL GC血液基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻后傾倒平板。從低濃度至高濃度配制各種濃度的平板。用多頭接種器將實驗菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液接種于各種濃度的平板，置36 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)36 h后觀察結(jié)果，記錄無菌落生長的MIC。以WHO的A、B、C、D、E標(biāo)準(zhǔn)菌株作質(zhì)控。(3)WHO在2012年對頭孢曲松、大觀霉素有了新的判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，各藥物判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：青霉素和環(huán)丙沙星小于或等于0.03 μg/mL判為敏感(S)，0.06～0.50 μg/mL判為中度敏感(D)，≥1 μg/mL判為耐藥(R)；頭孢曲松MIC<0.125 μg/mL敏感，MIC≥0.125 μg/mL中度敏感，大觀霉素MIC≤64 μg/mL敏感，MIC≥128 μg/mL耐藥。產(chǎn)青霉素酶淋球菌(PPNG)是β-內(nèi)酰胺酶陽性和耐四環(huán)素淋球菌(TRNG)是四環(huán)素MIC≤16 μg/mL。

1.2.3β-內(nèi)酰胺酶測定采用紙片碘量法測定菌株的β-內(nèi)酰胺酶，具體如下。取1 試管加入100 μL青霉素溶液(10 000 U/mL)，100 μL淀粉溶液(1%)，50 μL 碘試劑，呈藍(lán)色混合物，在一濾紙條上滴50 μL 試劑，將一接種環(huán)培養(yǎng)物涂在藍(lán)點上，放置1～2 min，如藍(lán)色變成無色即為β-內(nèi)酰胺酶陽性，顏色無變化則為陰性。每次試驗以WHO E株作陽性對照，A株作陰性對照。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

1 324株淋球菌中，2000～2005年度PPNG檢出率占23.5%(156/665)，2008～2014年度PPNG檢出率占36.4%(240/659),兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2000～2005年度TRNG檢出率占33.4%(222/665)，2008～2014年度TRNG檢出率占42.6%(281/659)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。青霉素耐藥率從71.1%(473/665)升高至87.1%(574/659)；環(huán)丙沙星耐藥率由88.9%(591/665)升至98.0%(646/659)；頭孢曲松中度敏感率從12.3%(82/665)提升到21.5%(142/659)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大觀霉素未發(fā)現(xiàn)耐藥菌，詳見表1。

表1　　2000～2005年和2008～2014年淋球菌的藥敏結(jié)果

續(xù)表1　　2000～2005年和2008～2014年淋球菌的藥敏結(jié)果

續(xù)表1　　2000～2005年和2008～2014年淋球菌的藥敏結(jié)果

3討論

淋球菌耐藥性因時間和地區(qū)的不同而有所變化。本單位從1998年加入了中國區(qū)域的淋球菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)，連續(xù)十幾年收集菌株，按規(guī)定時間統(tǒng)一進(jìn)行MIC測定。表1中2000～2005年度對青霉素的耐藥率與2008～2014年度對青霉素的耐藥率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=51.0，P<0.05)，與廣州[3]、上海[4]、南京[5]等相關(guān)報道類似；而且從2001年開始，沒有發(fā)現(xiàn)對青霉素敏感的菌株，2014年偶然出現(xiàn)1株敏感株。近幾十年來，世界各地出現(xiàn)了越來越多對青霉素和四環(huán)素的耐藥菌株，該藥物已經(jīng)不再作為治療淋病的首選藥物，但是PPNG/TRNG仍然作為淋球菌耐藥監(jiān)測的主要指標(biāo)。從本研究結(jié)果顯示，2008～2014年度PPNG檢出率36.4%和TRNG檢出率42.6%，較本單位于1998年淋球菌耐藥監(jiān)測的PPNG 3.2%和TRNG 1.6%上升了接近11.3倍以上[6]。2000～2005年度PPNG 23.5%和TRNG 33.4%與2008～2014年度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.5，χ2=12.0，P<0.05)，與廣州相關(guān)報道一致，1999～2001年P(guān)PNG從2%廣泛迅速地升到21.8%[3]；上海地區(qū)PPNG 37.8%和TRNG 20.1%[4]。類似報道還有南京地區(qū)PPNG從8.0%～44.4%和TRNG從8%～32.8%[5]。而韓國PPNG從2000年64%下降到2006年21%，同時TRNG則從3%上升到9%[7]。2000～2009年加拿大PPNG從3.0%上升到9.0%，TRNG從3.4%下降到1.6%，呈遞減趨勢[8]。這些全球不同地域的不同變化，是否與臨床有效的診斷、有效的抗菌藥物治療及性活動、性行為的變化有關(guān)系，有待進(jìn)一步研究，從而提示了對青霉素、四環(huán)素進(jìn)行追蹤監(jiān)測有重大意義。

十九世紀(jì)八十年代后期，喹諾酮類是治療淋病的首選藥物，但近二十多年，一些國家耐喹諾酮類藥物的淋球菌株急劇出現(xiàn)。本次監(jiān)測結(jié)果顯示從2002年開始對環(huán)丙沙星耐藥率高達(dá)93%以上，2000～2005年度從88.9%升至2008～2014年度的98.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，耐藥性非常高(MIC50≥8 μg/mL和MIC90≥32 μg/mL)。隨時間推移，有連續(xù)報道中國的其他地方對環(huán)丙沙星耐藥率有類似的增高[4-5]，因此，目前中國，環(huán)丙沙星不再作為治療淋病的推薦藥物，臨床多數(shù)用第三代頭孢菌素類治療淋病。

與青霉素和環(huán)丙沙星對比，表中兩個階段沒有發(fā)現(xiàn)對大觀霉素耐藥(MIC≥128 μg/mL)的菌株。在大觀霉素敏感判斷點MIC(64 μg/mL)附近，2000～2005年度沒有出現(xiàn)淋球菌菌株，而2008～2014年度首次發(fā)現(xiàn)菌株40/559(7.2%該菌株在敏感范圍)，預(yù)示著對大觀霉素持續(xù)藥物監(jiān)測十分重要。盡管80年代中期，淋球菌對大觀霉素的耐藥菌株非常稀少，但一些國家還是有報道分離出少數(shù)耐藥菌株，如1990～1998年的哥倫比亞、委內(nèi)瑞拉[9]，2000年的越南、韓國和巴布亞新幾內(nèi)亞[10]，中國的廣州(2/793)和南京(8/1 208)也有少數(shù)耐大觀霉素藥物的菌株報道[3-5]。WHO認(rèn)為，當(dāng)一種藥物的耐藥率超過5%時，該藥物就不應(yīng)該作為治療該病的一線藥物。然而，盡管中國及其他國家偶然檢測到大觀霉素耐藥菌株，大觀霉素仍然是有效藥物，繼續(xù)作為廣州地區(qū)初次治療淋病的首選藥物，也是頭孢菌素過敏患者治療淋病的選擇藥物[11]。

中國沒有報道頭孢曲松臨床治療失效的案例，但頭孢曲松MIC50、MIC90逐年增高，一些國家已經(jīng)提出了一個重大的公共衛(wèi)生問題——無法治愈淋病(“超級淋病”)。本資料顯示頭孢曲松MIC50(0.015 6～0.062 5 μg/mL)和MIC90(0.062 5～0.250 0 μg/mL)差異不明顯，活性較強。頭孢曲松的中度敏感率和MIC50、MIC90一樣，都是值得關(guān)注的，中度敏感(MIC≥0.125 μg/mL)菌株，從2000～2005年度12.3%增至2008～2014年度21.5%，經(jīng)χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.0，P<0.05)。頭孢曲松中度敏感率與上海的分析結(jié)果相似11.9%[4]，但低于南京最近的報道32.9%[12]。此外，在2000～2005年值得關(guān)注的是對頭孢曲松中度敏感的菌株已經(jīng)超過5%，而2008～2014年度頭孢曲松MIC 0.5 μg/mL 首次檢測分離出6/559，提示了頭孢曲松MIC值不斷上升及廣州地區(qū)淋球菌對頭孢曲松可能耐藥。一些國家建議加大頭孢曲松的肌注劑量，以減緩淋球菌的頭孢菌素耐藥菌株擴(kuò)散[13]。2007年，中國推薦使用單劑量250 mg頭孢曲松進(jìn)行肌肉注射作為淋病的首選治療；借鑒國際組織指導(dǎo)方針建議和中國南京一樣[12]，廣州治療淋病使用較高劑量(≥500 mg)頭孢曲松肌注。

總之，廣州地區(qū)淋球菌對青霉素和環(huán)丙沙星耐藥，從2000～2005年度到2008～2014年度，耐藥(PPNG和TRNG)迅速增加，沒有發(fā)現(xiàn)頭孢曲松耐藥菌株，但對頭孢曲松(MIC≥0.5μg/mL)和大觀霉素(MIC≥64μg/mL)的高水平MIC值在第二年度首次出現(xiàn)，與海南地區(qū)類似[14]。

大觀霉素活性仍然最強，具有良好臨床療效，可以作為治療淋病的優(yōu)選藥物，因此，加強淋球菌耐藥性的長期監(jiān)測非常重要。

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Trends of antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae isolated from Guangzhou

LiXiaodong,LiangJingyao,BiCao,LiPing,LiangYanhua,LinLuyang,WangHuanli,ZhangXibao,CaoWenling△

(DepartmentofClinicalLaboratory,GuangzhouInstituteofDermatology,Guangzhou,Guangdong510095,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate,in the past thirteen years,the developing trends of resistance of Neisseria gonorrhoeae to 5 antibiotics and the prevalence of penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae (PPNG) and high level tetracycline resistant Neisseria gonorrhoeae (TRNG).MethodsMinimum inhibitory concentration (MIC) to ceftriaxone,spectiomycin,ciprofloxacin,and Penicillin were determined using the agar dilution method,and β-lactamase by paper iodine quantitative method.ResultsA total of 1 324 Neisseria gonorrhoeae isolates were studied,including 665 samples from 2000 to 2005 and 659 samples from 2008 to 2014.Between 2000-2005 and 2008-2014,the rates of PPNG and TRNG isolates significantly increased from 23.5%(156/665) to 36.4%(240/659),the difference was statistically significant(P<0.05) and from 33.4%(222/665) to 42.6%(281/659),the difference was statistically significant(P<0.05) respectively.The proportion of resistant strains to penicillin remarkably rose from 71.1%(473/665) to 87.1%(574/659),the difference was statistically significant(P<0.05).Like penicillin,the percentage of resistant strains to ciprofloxacin significantly increased from 88.9%(591/665) to 98.0%(646/659),the difference was statistically significant(P<0.05).Intermediate susceptible isolates to ceftriaxone increased from 12.3%(82/665) to 21.5%(142/659),the difference was statistically significant(P<0.05).No isolates resistant to spectinomycin were identified over the years.ConclusionThe study shows that it is important to strengthen the Neisseria gonorrhoeae surveillance of antimicrobial resistance as well as spectinomycin is successively as first drug of choice for treatment of Neisseria gonorrhoeae.

Key words:Neisseria gonorrhoeae;minimal inhibitory concentration;antimicrobial resistance

(收稿日期：2015-10-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.017

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)04-0472-04

作者簡介：黎小東，女，副主任技師，主要從事微生物學(xué)和免疫學(xué)研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：CLLaz@163.com。