韓園芳，冀林華，劉芳，馮婷婷，李建平，馬曉靜，崔森，李占全

(1青海大學醫(yī)學院，西寧 810000；2青海大學附屬醫(yī)院；3青海大學；4青海省人民醫(yī)院)

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慢性高原病患者骨髓有核紅細胞Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表達變化

韓園芳1，冀林華2，劉芳3，馮婷婷1，李建平4，馬曉靜2，崔森2，李占全2

(1青海大學醫(yī)學院，西寧 810000；2青海大學附屬醫(yī)院；3青海大學；4青海省人民醫(yī)院)

摘要：目的觀察慢性高原病(CMS)患者骨髓有核紅細胞Ras相關GTP酶(Ras-GTP)分泌水平及B型絲/蘇氨酸蛋白激酶(BRaf)、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)、細胞信號調節(jié)激酶1(ERK1)、細胞信號調節(jié)激酶2(ERK2)表達變化。方法 CMS患者15例(觀察組)，單純陳舊性骨折患者15例(對照組)，采用ELISA法檢測骨髓有核紅細胞Ras-GTP，實時熒光定量PCR法檢測骨髓有核紅細胞BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA。結果與對照組比較，觀察組Ras-GTP分泌水平升高，BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相對表達量增加(P均<0.05)。觀察組Ras-GTP、Braf mRNA、MEK mRNA、ERK1 mRNA、ERK2 mRNA與HGB呈正相關(r分別為0.860、0.849、0.653、0.773、0.746，P均<0.01)。結論 CMS患者骨髓有核紅細胞Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2表達升高，Ras/Raf/MEK/ERK通路可能與CMS紅細胞的過度累積有關，推測其可能是CMS發(fā)病機制中的重要通路之一。

關鍵詞：高原??；骨髓有核紅細胞；Ras/Raf/MEK/ERK信號通路

慢性高原病(CMS)既往又稱為高原紅細胞增多癥，以過度紅細胞增多和嚴重低氧血癥為特征[1]，并伴有血紅蛋白(HGB)及紅細胞壓積升高，但目前其發(fā)病機制尚未完全闡明。研究[2]認為，CMS發(fā)生病理生理改變的主要機制是機體對高原環(huán)境失適應，導致細胞內低氧，引起低氧誘導因子表達增加，促進促紅細胞生成素(EPO)、血管內皮生長因子(VEGF)等下游基因的表達，從而促進細胞的增殖。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路通過瀑布式的激活過程將細胞外的信號傳遞到細胞核，通過調節(jié)細胞周期調控細胞的增殖、分化和凋亡。本研究觀察了CMS患者骨髓有核紅細胞Ras-GTP分泌水平及B型絲/蘇氨酸蛋白激酶(BRaf)、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)、細胞信號調節(jié)激酶1(ERK1)、細胞信號調節(jié)激酶2(ERK2)表達變化，并探討其意義。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2014年9月～2015年10月青海大學附屬醫(yī)院收治的CMS[1]患者15例(觀察組)，均為男性，年齡(50.4±3.5)歲；均為漢族，且長期居住在海拔2 500 m以上的地區(qū)。另選15例單純陳舊性骨折患者作為對照組，患者均為男性，年齡(48.9±2.3)歲。兩組一般資料比較無統(tǒng)計學差異，具有可比性。所有受試對象均簽署知情同意書，并經(jīng)青海大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2骨髓有核紅細胞采集、分選及培養(yǎng)采集受試對象骨髓液10 mL，用Ficoll淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞，以CD71、CD235a抗體磁珠分選陽性細胞，將分選的CD71、CD235a陽性細胞以1×106/mL培養(yǎng)于5 mL IMDM培養(yǎng)體系中(含30%胎牛血清、20 ng/μL IL-3、10 μmol/mL EPO、69%IMDM)，37 ℃、5%CO2、3%O2的培養(yǎng)箱內低氧培養(yǎng)72 h。

1.3骨髓有核紅細胞分泌的Ras-GTP檢測將培養(yǎng)后的骨髓有核紅細胞以800 r/min離心，收集離心后的上清液，采用ELISA法檢測Ras-GTP，操作嚴格按ELISA試劑盒說明進行。

1.4骨髓有核紅細胞BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA檢測收集培養(yǎng)后的有核紅細胞，按TRIzol 試劑盒說明裂解細胞，提取總RNA。采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，用于PCR擴增，50 ℃、2 min，95 ℃、15 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物于Roche LightCycler?480Ⅱ實時熒光定量PCR系統(tǒng)掃描，讀取CT值。目的基因的相對表達量以2-ΔΔCT表示。

1.5外周血HGB、血氧飽和度、紅細胞壓積檢測抽取受試者外周血，采用XE-2100全自動細胞分析儀檢測HGB、紅細胞壓積，指套式光電傳感器檢測血氧飽和度。

2結果

兩組Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相對表達量比較見表1。兩組外周血HGB、血氧飽和度、紅細胞壓積比較見表2。觀察組中Ras-GTP、Braf mRNA、MEK mRNA、ERK1 mRNA、ERK2 mRNA與HGB呈正相關(r分別為0.860、0.849、0.653、0.773、0.746，P均<0.01)。

表1　兩組Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

表2　兩組HGB、血氧飽和度、紅細胞壓積比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

3討論

CMS是以過度紅細胞增多和嚴重低氧血癥為特征[1]，并伴有HGB及紅細胞壓積升高。研究[3]發(fā)現(xiàn)，CMS骨髓紅細胞增生明顯活躍，以晚幼紅細胞增生明顯，且骨髓組織血管增生顯著。

近年來，Ras/Raf/MEK/ERK信號傳導通路與低氧相關性疾病的關系越來越受到重視。發(fā)生CMS時，低氧誘導因子高表達，可廣泛激活眾多低氧反應基因如EPO、VEGF等，EPO可與促紅細胞生成素受體(EPOR)相互作用而激活JAK2基因[4]，使EPOR磷酸化，EPOR胞質SH2結構域與Grb2結合，吸引具有鳥苷酸交換因子活性的SOS至細胞膜，促進Ras-GDP轉換為Ras-GTP，導致Ras活化，依次激活MEK、ERK，進入核內促進多種轉錄因子磷酸化，從而調控細胞增殖、分化、凋亡、轉移等功能[5～7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，CMS患者VEGF水平升高，VEGF在CMS中的作用主要是誘導血管形成，增強血管的通透性。而VEGF不僅僅是血管生成因子，而且與造血調節(jié)有密切關系。VEGF作為肝表面細胞膜生長因子，受到刺激過度表達時，會激活Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，此通路持續(xù)活化后，通過抑制細胞凋亡、促進細胞存活及促進耐藥基因的表達，最終導致肝細胞異常增殖及腫瘤形成[9]。Ras/Raf/MEK/ERK通路不僅與肝細胞癌有關，在多種實體腫瘤及其他疾病中均檢測到該通路的異常激活，如食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、口腔癌、自閉癥等[10～14]。

本研究顯示，觀察組Ras-GTP分泌水平較對照組升高，BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相對表達量較對照組增加；觀察組Ras-GTP、Braf mRNA、MEK mRNA、ERK1 mRNA、ERK2 mRNA與HGB呈正相關。提示Ras/Raf/MEK/ERK通路可能與CMS紅細胞的過度累積有一定關系，推測其可能是CMS發(fā)病機制中的重要通路之一。

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(收稿日期:2015-11-05)

中圖分類號：R555.1

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)03-0052-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.019

通信作者：冀林華(E-mail: lindaji1@163.com)

基金項目：青海省科技廳國際合作項目(2014-HZ-808)；國家自然科學基金資助項目(81441116)；青海省科技廳(應用)基礎研究計劃項目(2012-Z-729)。