朱　琳， 賀　巍， 楊生岳， 范興愛， 劉睿年， 陳　磊

(解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，西寧　810007； *通信作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

急進(jìn)高原對(duì)大鼠胃電活動(dòng)及胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)和功能的影響

朱琳， 賀巍*， 楊生岳， 范興愛， 劉睿年， 陳磊

(解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，西寧810007；*通信作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

摘要：目的探討急進(jìn)高原后不同海拔高度及不同時(shí)間節(jié)段下大鼠胃電活動(dòng)變化及其對(duì)胃Cajal(interstitial cell of Cajal，ICC)間質(zhì)細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)和功能的影響。方法130只SD雄性大鼠隨機(jī)分為低海拔地區(qū)組(西安，海拔400 m)，中度海拔地區(qū)(西寧，海拔2 260 m)和高海拔地區(qū)(瑪多，海拔4 300 m)，中度和高度海拔組又以急進(jìn)高原的時(shí)間分為1 d，3 d，5 d，7 d，10 d和14 d組，每組10只大鼠。測(cè)定各組大鼠胃電活動(dòng)數(shù)據(jù)，并應(yīng)用免疫熒光染色及電子顯微鏡觀察胃電起搏區(qū)ICC的功能及微觀結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果大鼠胃電的波幅及波頻在中度海拔地區(qū)5 d組及高海拔地區(qū)3 d組下行到最低點(diǎn)(P<0.05)，且高海拔地區(qū)3 d組受損更加明顯(P<0.05)。大鼠胃電起搏區(qū)ICC的功能及微觀結(jié)構(gòu)也可同步觀察到類似改變，于中度海拔地區(qū)5 d組及高海拔地區(qū)3 d組受損最明顯，電鏡下可觀察到ICC的縫隙連接減少、細(xì)胞器減少并出現(xiàn)凋亡小體等，并以高海拔地區(qū)3 d組最顯著。用c-kit免疫熒光標(biāo)記同部位ICC，也可觀察到中度海拔地區(qū)5 d組及高海拔地區(qū)3 d組免疫熒光強(qiáng)度最低(P<0.05)，且高海拔地區(qū)3 d組降低更顯著(P<0.05)。結(jié)論急進(jìn)高原對(duì)于大鼠胃電活動(dòng)影響顯著，且海拔高度越高，大鼠胃電活動(dòng)受損越嚴(yán)重，下行的速度越快，越早到達(dá)最低點(diǎn)。大鼠胃電起搏區(qū)的ICC微觀結(jié)構(gòu)及功能也出現(xiàn)相應(yīng)同步損害，表明，ICC可能在急進(jìn)高原胃動(dòng)力紊亂形成機(jī)制中廣泛參與并發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：高原??；高海拔；胃動(dòng)力；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；大鼠

近年來隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及交通條件的大幅改善，尤其是青藏鐵路的開通，每年因旅游、科研、朝圣及工作需要等原因進(jìn)入青藏高原活動(dòng)的人數(shù)多達(dá)數(shù)百萬[1]，而高原獨(dú)有的氣壓低、含氧低、氣溫低、紫外線強(qiáng)等自然環(huán)境會(huì)對(duì)機(jī)體造成很多影響，從而引發(fā)呼吸、循環(huán)、神經(jīng)、消化等多系統(tǒng)損傷，產(chǎn)生功能紊亂[2]。其中，急進(jìn)高原胃腸動(dòng)力紊亂是高原胃腸應(yīng)激反應(yīng)的主要表現(xiàn)之一，以腹脹、惡心、嘔吐、腹瀉、食欲減退等消化道癥狀最為突出，這些癥狀一般經(jīng)7-10 d的高原適應(yīng)后逐漸減輕或消失[3]。

目前有關(guān)于高原胃腸動(dòng)力紊亂的研究多集中在臨床及部分基礎(chǔ)研究上，以應(yīng)用B超、X線鋇餐、激素測(cè)定、內(nèi)鏡等檢查手段觀測(cè)高原應(yīng)激時(shí)的胃腸動(dòng)力變化為主，而詳細(xì)探討高原胃腸動(dòng)力紊亂變化規(guī)律，以及其形成機(jī)制的細(xì)胞分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究則少見報(bào)道[4]。另外，既往的研究表明ICC具有產(chǎn)生、傳播慢波的功能，并以胃電發(fā)生起搏細(xì)胞的角色，在胃腸道動(dòng)力的產(chǎn)生及調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-7]。那么急進(jìn)高原后大鼠胃運(yùn)動(dòng)發(fā)生紊亂時(shí)，其胃電活動(dòng)是如何發(fā)生變化的，胃電起搏區(qū)ICC的微觀結(jié)構(gòu)及功能是否也存在相應(yīng)改變，它們之間有何關(guān)聯(lián)變化，將是我們研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將測(cè)定急進(jìn)高原不同海拔不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)下大鼠胃電活動(dòng)變化情況，并同時(shí)使用電子顯微鏡及免疫熒光標(biāo)記的方式，觀察急進(jìn)高原對(duì)大鼠胃電起搏區(qū)ICC微觀結(jié)構(gòu)及功能的影響，為進(jìn)一步探討急進(jìn)高原胃腸動(dòng)力紊亂的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要儀器及試劑

RM6280B生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠生產(chǎn))，超低溫冰箱(-80 ℃)及超低溫切片機(jī)(美國(guó)NUAIR公司)，F(xiàn)V1000激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，TecnaiG2分析透射電鏡(美國(guó)FEI公司)，兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(LifeSpan BioSciences公司)，羊抗兔IgG alexa fluor 594單克隆抗體(美國(guó)Jackson公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SD雄性大鼠130只，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003，體重(200±20)g，全部購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3大組13小組。即以實(shí)驗(yàn)地區(qū)海拔高度劃分3大組，A組低海拔地區(qū)組(西安，海拔400 m)、B組中度海拔地區(qū)組(西寧，海拔2 260 m)、C組高海拔地區(qū)組(瑪多，海拔4 300 m)。另以大鼠起運(yùn)后3 d內(nèi)進(jìn)駐實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)模擬急進(jìn)高原狀態(tài)，并以進(jìn)駐后的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為依據(jù)，依達(dá)到實(shí)驗(yàn)地區(qū)后的時(shí)間順序于B、C兩組下設(shè)6個(gè)亞組，即：1 d,3 d,5 d,7 d,10 d,14 d組，每組10只大鼠。

1.3胃電生理活動(dòng)檢測(cè)

SD大鼠術(shù)前12 h禁食，術(shù)前6 h禁水，戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，通過大鼠腹部正中切開，選擇胃電起搏區(qū)的胃體中部上1/3處漿膜層埋置引導(dǎo)電極[8]，測(cè)量胃電活動(dòng)變化，參數(shù)設(shè)定為“生物電，500 mV，直流，30 Hz”，記錄波形并分析。

1.4實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集與固定

電生理測(cè)定完成后處死大鼠，剪開胸腔，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，快速灌入生理鹽水沖去血液，并沿胃大彎測(cè)剪開，于胃體中部上1/3處取0.2 cm×0.1 cm大小組織，放入3%戊二醛固定用于電鏡染色，后繼續(xù)經(jīng)升主動(dòng)脈先快后慢灌注冷的(4 ℃)4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH7.4)500 ml，注畢立即取全胃置于20%的蔗糖溶液中過夜沉底。

1.5電鏡觀察胃電起搏區(qū)ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)變化

取3%戊二醛固定后組織用0.2 mol/L蔗糖磷酸緩沖液漂洗，再用2%的四氧化鋨后固定1 h，丙酮中梯度脫水，在1%醋酸雙氧鈾中停滯染色1 h，再通過環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂。1 mm切片用亞甲藍(lán)染色，在光鏡下觀察，確定黏膜層、環(huán)形肌層、縱行肌層，再次經(jīng)70 nm超薄切片后用酒精醋酸雙氧鈾、再用檸檬酸鹽后染色，保留縱行肌層、環(huán)形肌層、黏膜下層、部分黏膜層，用透射電鏡觀察、照相。

1.6免疫熒光化學(xué)法標(biāo)記ICC后圖像分析

取固定后胃體中部上1/3處0.4 cm×0.2 cm組織用超低溫切片機(jī)切片10 μm，使用0.01 mol/L PBS反復(fù)漂洗3次后，置入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室溫)，再經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗后進(jìn)行免疫組織化學(xué)熒光染色(以c-kit抗體標(biāo)記ICC細(xì)胞)：加入兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(1∶150)孵育24 h(室溫)，經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗3次后，所有切片均加入羊抗兔IgG alexa fluor 594單克隆抗體(1∶300)，避光孵育2 h(室溫)。經(jīng)0.01 mol/L PBS洗3次后，80%甘油封片，以上過程均需避光操作。各組切片各取10張，在FV1000激光共聚焦顯微鏡下采用20倍及40倍視野觀察，觀察每一張切片取6-8個(gè)視野，并將數(shù)字化圖像儲(chǔ)存。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1急進(jìn)高原后大鼠在中度海拔及高海拔地區(qū)各時(shí)間段下的電生理變化

急進(jìn)高原后隨著海拔高度的升高，胃電的波頻及波幅受損明顯，且海拔高度越高，受損下行越快，越早到達(dá)最低點(diǎn)(見表1，2，圖1)。在中度海拔地區(qū)胃電波頻變化不明顯，僅在5 d組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而波幅相對(duì)變化顯著，1 d組即可觀察到明顯變化(P<0.05)，至5 d組下降到最低點(diǎn)(P<0.05)。而高海拔地區(qū)則可以觀察到明顯波頻、波幅變化，并均于3 d組達(dá)到最低點(diǎn)(P<0.05)，且高海拔地區(qū)大鼠胃電活動(dòng)受損情況較中度海拔地區(qū)最低點(diǎn)時(shí)顯著下降，高海拔1 d組與中度海拔1 d組比較，高海拔3 d組與中度海拔5 d組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外通過實(shí)驗(yàn)觀察可見，海拔高度對(duì)于波頻的影響相對(duì)較低，較易恢復(fù)，中度海拔地區(qū)在7 d組，高海拔地區(qū)在5 d組即基本恢復(fù)正常，與低海拔組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而波幅恢復(fù)相對(duì)較慢，且所處海拔高度越高恢復(fù)越慢。

組別1d3d5d7d10d14d低海拔組1839.31±611.46 中度海拔組 581.96±207.22*259.77±28.71 222.08±55.04#264.68±38.73430.77±147.64670.12±169.74高海拔組 265.30±39.52*△173.98±26.29▲★214.25±44.01333.31±81.87391.83±78.84507.67±108.25

與低海拔組比較，*P<0.05；與中度海拔1 d組比較，△P<0.05；與中度海拔5 d組比較，▲P<0.05; 中度海拔組與3 d及7 d組比較，#P<0.05；高海拔組與1 d及5 d組比較，★P<0.05

組別1d3d5d7d10d14d低海拔組49.67±0.96中度海拔組49.56±0.7748.72±1.6748.54±2.11*49.45±0.8649.8±0.3249.84±0.44高海拔組 48.42±1.48*△ 44.63±0.87#▲49.21±1.02 49.4±1.2549.71±0.6 49.88±0.33

與低海拔組比較，*P<0.05；與中度海拔1 d組比較，△P<0.05；與中度海拔5 d組比較，▲P<0.05；高海拔組與1 d及5 d組比較，#P<0.05

A為低海拔組； B1-B6分別為中度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組； C1-C6分別為高度度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組 圖1　大鼠快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后胃電活動(dòng)時(shí)程變化Figure 1　Effects of ascending to high altitude on gastric electrical activity in the rats

2.2急進(jìn)高原后大鼠在中度海拔及高海拔地區(qū)各時(shí)間段下胃電起搏區(qū)的ICC的微觀結(jié)構(gòu)變化

低海拔地區(qū)對(duì)照組ICC在電鏡下觀察可見：細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，縫隙連接緊密，核周細(xì)胞質(zhì)充盈，細(xì)胞器數(shù)量較多，細(xì)胞內(nèi)部罕見空泡樣改變，無凋亡小體。急進(jìn)高原地區(qū)后，細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)受外界環(huán)境影響、受損，尤其在中度海拔地區(qū)5 d組及高海拔地區(qū)3 d組表現(xiàn)最為明顯。ICC細(xì)胞縫隙連接變得松散、減少；核周細(xì)胞質(zhì)空泡樣改變加重，甚至部分ICC基膜不完整形成空洞；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，細(xì)胞線粒體可見空泡樣腫脹，部分可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張；部分形成核固縮，核內(nèi)可見異染色質(zhì)，凋亡小體明顯增多；更嚴(yán)重的可見尚存細(xì)胞的連接結(jié)構(gòu)明顯破壞，連接松散，核周胞質(zhì)顯著減少，線粒體腫脹變性，空洞隨處可見，核內(nèi)可見大量凋亡小體及異染色質(zhì)(見圖2)。

2.3急進(jìn)高原后大鼠在中度海拔及高海拔地區(qū)各時(shí)間段下胃電起搏區(qū)的c-kit表達(dá)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不論是中度海拔地區(qū)還是高海拔地區(qū)，與低海拔地區(qū)對(duì)照組相比，大鼠胃電起搏區(qū)c-kit表達(dá)明顯下降，1 d組即出現(xiàn)明顯變化(P<0.05)，且進(jìn)入地區(qū)的海拔高度越高下降幅度越快，中度海拔地區(qū)于5 d組到達(dá)最低點(diǎn)(P<0.05)，高海拔地區(qū)于3 d組下行到最低點(diǎn)(P<0.05)，而后緩慢恢復(fù)。且海拔越高影響越嚴(yán)重，高海拔地區(qū)3 d組與中度海拔地區(qū)5 d組比較c-kit表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱(P<0.05，見表3，圖3)。

A1,A2為低海拔組； B1-B6分別為中度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組； C1-C6分別為高度度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組圖2　大鼠快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后對(duì)胃電起搏區(qū)ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響Figure 2　Effects of ascending to high altitude on ultrastructure of ICC in the gastric pacing location

組別1d3d5d7d10d14d低海拔組45.85±1.78中度海拔組37.36±1.72*35.88±1.67 33.4±1.71#35.32±1.5936.14±1.7937.29±2.46高海拔組33.27±2.05*△30.77±1.98▲★31.87±1.9333.1±2.1833.57±1.7935.95±2.01

與低海拔組比較，*P<0.05；與中度海拔1 d組比較，△P<0.05；與中度海拔5 d組比較，▲P<0.05;中度海拔組與3 d組及7 d組比較，#P<0.05; 高海拔組與1 d組及5 d組比較，★P<0.05

A，Aa為低海拔組； B1-B6分別為中度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組； C1-C6分別為高度度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組圖3　大鼠快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后對(duì)胃電起搏區(qū)c-kit表達(dá)變化Figure 3　Expression of c-kit in ICCs in rats gastric pacing location after ascending to high altitude

3討論

初入高原者易引發(fā)機(jī)體低張性缺氧，為了保障心、腦等重要臟器的供養(yǎng)，機(jī)體需調(diào)整體內(nèi)血液分布進(jìn)而收縮皮膚及胃腸道血管，造成一系列消化道癥狀。高原胃腸應(yīng)激反應(yīng)是急性高原病的常見表現(xiàn)，消化系統(tǒng)功能障礙甚至能夠進(jìn)一步加重其他原發(fā)高原疾病的病情，造成嚴(yán)重后果[9]。目前在高原胃腸動(dòng)力紊亂的研究領(lǐng)域，有關(guān)胃腸電節(jié)律規(guī)律性變化的研究、報(bào)道尚不多，尤其是詳細(xì)描述整個(gè)受損、恢復(fù)過程的報(bào)道尚罕見。目前已知的研究表明ICC作為慢波的起源細(xì)胞可與腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)及消化道平滑肌(smooth muscle cell，SMC)形成網(wǎng)絡(luò)狀連接，并組成胃腸動(dòng)力的基本功能單位(basically functional unit GI motility，BFUGM)[10]，它同時(shí)與抑制性和興奮性神經(jīng)纖維形成緊密聯(lián)接，在ENS和SMC之間的進(jìn)行信息傳遞[4]，進(jìn)而影響胃腸的基本電節(jié)律造，并以此來調(diào)控胃腸運(yùn)動(dòng)[11-14]。近年來大量的研究表明[15-17]，諸多胃腸動(dòng)力障礙疾病的患者存在ICC功能的損傷，如：糖尿病胃輕癱、慢性便秘、功能性消化不良等，其主要表現(xiàn)在ICC數(shù)量的減少、缺失及ICC網(wǎng)絡(luò)的受損及神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常等，并最終導(dǎo)致慢波的異常，進(jìn)而引起胃腸動(dòng)力疾病或障礙?？梢钥闯鲈谖改c動(dòng)力障礙疾病的研究領(lǐng)域中，ICC細(xì)胞的地位不容忽視，十分重要。

通過觀察急進(jìn)高原后大鼠胃電活動(dòng)的變化規(guī)律可以發(fā)現(xiàn)，海拔高度對(duì)大鼠胃電活動(dòng)影響明顯，進(jìn)入地區(qū)的海拔高度越高，受損越嚴(yán)重，胃電活動(dòng)下行的速度越快，尤以波幅為著。在中度海拔地區(qū)1 d組大鼠胃電波幅下降顯著而波頻下降不明顯，于5 d組胃電波幅降至最低谷時(shí)胃電波頻才顯著下降，此后胃電波頻快速恢復(fù)，而波幅則恢復(fù)相對(duì)緩慢。高海拔地區(qū)測(cè)量結(jié)果與之類似，但大鼠胃電活動(dòng)受損更為明顯，不論波頻還是波幅均在1 d組即可觀察到顯著下降，并于3 d組到達(dá)最低點(diǎn)，且其下行幅度與中度海拔地區(qū)5 d組相比受損更加嚴(yán)重，同樣是波頻先恢復(fù)，而波幅恢復(fù)速度較西寧地區(qū)更加緩慢。此外，使用電子顯微鏡觀察各組大鼠胃電起搏區(qū)ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化，并結(jié)合ICC表達(dá)量的變化進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)類似的損傷變化規(guī)律，即急進(jìn)高原大鼠胃電活動(dòng)受損發(fā)生下行變化時(shí)，ICC的微觀結(jié)構(gòu)及表達(dá)量也同步發(fā)生損傷變化，海拔高度越高，ICC微觀結(jié)構(gòu)受損越嚴(yán)重，代表ICC表達(dá)量的免疫熒光強(qiáng)度值越低，并同樣于中度海拔5 d組、高海拔3 d組下行到最低點(diǎn)，且后者下降幅度更大，恢復(fù)更慢?？梢姶笫筮M(jìn)入高海拔地區(qū)后，其胃電活動(dòng)變化與胃電起搏區(qū)ICC微觀結(jié)構(gòu)及功能變化存在明顯的關(guān)聯(lián)性，因此我們分析急速進(jìn)入高海拔地區(qū)后，在胃動(dòng)力紊亂的發(fā)生機(jī)制中，ICC細(xì)胞可能廣泛參與其中并發(fā)揮重要作用，這將為我們以后進(jìn)一步探討急進(jìn)高原胃腸動(dòng)力紊亂的發(fā)生機(jī)制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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Effects of ascending to high altitude on gastric motility, ultrastructure and function of interstitial cell of Cajal in the rats

ZHU Lin, HE Wei*, YANG Shengyue, FAN Xingai, LIU Ruinian, CHEN Lei

(DepartmentofGastroenterology,FourthHospitalofPLA,Xining810007,China;*Correspondingauthor,E-mail:hewei.1971@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the influence of different altitude and duration time on the gastric electrical activities, the ultrastructure and physiological function of ICCs in high altitude-exposed rats.MethodsA total of 130 SD male rats were divided into three groups: low(Xi’an, 400 m), moderate(Xining, 2 260 m) and high altitude(Maduo, 4 300 m) groups. On the basis of duration time after entering the plateau, the moderate and high altitude groups were further divided into six subgroups(n=10 in each group): 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 10 d, and 14 d groups. The gastric electrical activity was recorded in different groups. Immunofluorescence staining and electron microscope were applied to observe the physiological function and ultrastructure of ICC cells in gastric electrical pacing region.ResultsThe amplitude and frequency of gastric electrical activity were the lowest in moderate altitude 5 d group and high altitude 3 d group(P<0.05). The damage in high altitude 3 d group was the most severe(P<0.05). The physiological function and ultrastructure of ICC cells showed the similar changes in gastric electrical pacing region. The gap junctions and organelles of ICC cells were reduced in moderate altitude 5 d group and high altitude 3 d group, and apoptotic bodies were observed under electron microscope, especially in high altitude 3 d group(P<0.05). The c-kit immunofluorescence results showed the same tend of changes.ConclusionThe gastric electrical activity in rats is significantly influenced by high altitude exposure, and the injury is more serious in higher altitude. The ultrastructure and function of ICCs in gastric pacing location are impaired in the same tendency. The results indicate that the ICCs may play an important role in gastric dynamic disorders in high altitude-exposed rats.

Key words:mountain sickness；high altitude；gastric motility；interstitial cell of Cajal；rats

基金項(xiàng)目：青海省(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究基金資助項(xiàng)目(2013-Z-760)

作者簡(jiǎn)介：朱琳，男，1979-11生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail:298567115@qq.com

收稿日期：2016-03-22

中圖分類號(hào)：R361

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)06-0505-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.005