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人臍血間充質(zhì)干細胞移植治療長骨骨折術(shù)后骨不連17例

由于近年骨科研究的進步，骨折愈合和治療的效果已得到極大提高，但在骨修復(fù)、骨折愈合程度上依然不足。干細胞的研究應(yīng)用給骨科疾病帶來了新的希望，它能在特定的信號作用下定向分化為骨細胞、神經(jīng)細胞、骨骼肌細胞等，成為特殊功能的生物組織。干細胞有三個主要來源，即胚胎、成體和臍血，由于臍血間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)取材容易，采集方便，供源充足，給骨組織工程帶來了一種新的、理想的種子細胞。本研究采用人臍血間充質(zhì)干細胞移植治療骨折術(shù)后骨不連患者17例，取得良好療效。

臨床資料：骨折術(shù)后骨不連患者17例，男10例，女7例；年齡22～65歲，平均36.8歲；病程8～32個月，平均12.5個月。納入標(biāo)準(zhǔn)：①骨折術(shù)后8個月檢查顯示無骨痂生長，骨折部位無進行性修復(fù)跡象，骨折片間隙<5 mm；②無短縮、成角及移位現(xiàn)象；③為非感染性骨不連；④行局部植骨后8個月仍無明顯骨痂生長。排除標(biāo)準(zhǔn)：①骨折術(shù)后8個月檢查顯示有部分骨架生長；②確診骨不連后行局部植骨后8個月有部分骨痂生長；③合并短縮、成角及移位現(xiàn)象；④骨折后骨折端及附近存在感染灶。17例患者中，肱骨骨折5例，脛骨干骨折9例，股骨骨折3例。

hUC-MSCs獲取及應(yīng)用：①hUC-MSCs獲?。簢栏駸o菌條件下，采集健康產(chǎn)婦志愿捐獻的臍帶血，取30 mL外周血，用PBS按照1∶3稀釋。采用密度梯度離心法，用人淋巴細胞分離液分離得到外周血單個核細胞，下層為人淋巴細胞分離液，上層為稀釋后的外周血，二者體積比為1∶2。以1 500 r/min離心40 min，5檔升速，0檔降速。離心取白膜層，PBS稀釋，330 g×15 min常溫離心。再用大體積PBS洗2遍，每遍330 g×10 min。經(jīng)過磁珠分選及培養(yǎng)獲得hUC-MSCs。取第3代細胞應(yīng)用條件培養(yǎng)基進行成骨誘導(dǎo)2周，控制移植用hUC-MSCs濃度>103/mL，總數(shù)>50×107個稀釋在30～50 mL中。②hUC-MSCs應(yīng)用：骨折斷端處消毒，行局部麻醉，在X線透視下，采用注射器針頭對骨折線定位，確認針尖處于骨折縫隙內(nèi)，將hUC-MSCs準(zhǔn)確注射到骨折端，注射時如感阻力較大，可加壓緩慢注射，術(shù)后略加壓包扎，不使用抗生素。每1～2周1次，連續(xù)4次。

療效評價方法：骨折愈合具體評分參照文獻[1]。①骨形成：沒有骨形成的表現(xiàn)計0分，骨形成占骨折區(qū)的25%計1分，骨形成占骨折區(qū)的50%計2分，骨形成占骨折區(qū)的75%計3分，骨形成填滿骨折斷端間隙計4分；②缺損連接：有完全的骨折線計0分，有部分骨折線計2分，缺乏骨折線計4分；③骨塑建：無塑建的表現(xiàn)計0分，可見髓腔內(nèi)塑建計2分，皮質(zhì)骨完全塑建計4分?？偡诌_11分以上即達到了良好的愈合效果。

結(jié)果：隨訪3～24個月，平均12.5個月。治療前骨折愈合評分(3.40±0.42)分，治療后愈合評分(11.23±0.35)分。愈合時間3～18個月，其中16例(94.12%)達到良好愈合。

討論：骨折術(shù)后骨不連是骨科常見并發(fā)癥之一，發(fā)生率為5%～10%[2]。對于骨折術(shù)后骨不連的治療方法較多，傳統(tǒng)方法常需植骨治療，植骨的來源主要分為自體骨移植和異體骨移植。自體骨移植修復(fù)骨缺損不存在免疫排斥，并同時具有骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)特性，但自體松質(zhì)骨數(shù)量有限，且供區(qū)可能會出現(xiàn)并發(fā)癥，臨床上常用于修復(fù)較小的骨缺損[3]。異體骨移植來源豐富，但異體移植需要長時間的固定，存在免疫排斥問題，且成骨活性較自體骨差，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

近年來，隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，給骨折術(shù)后骨不連患者的治療提供了一個全新的解決方案[4]，其在骨折不愈合、脊髓損傷、周圍神經(jīng)損傷等疾病中的應(yīng)用均取得了良好效果。相對于傳統(tǒng)治療，MSCs有以下特點及優(yōu)點：①干細胞是原始分化細胞，移植后對受體的免疫排斥反應(yīng)小；②對于一般性方法難以治愈的復(fù)雜疾病常有良好的效果；③大量實驗及臨床研究表明治療效果確切，且有效率高；④治療過程創(chuàng)傷性小、無痛苦，操作簡單、安全；⑤治療周期短，無明顯不良反應(yīng)，無依賴性；⑥不僅對疾病本身有效，還能對其他人體系統(tǒng)器官有補益作用。

研究[5,6]表明，MSCs能夠向成骨細胞分化，移植MSCs能夠利用其定向骨分化使骨不連愈合，許多專家采用骨髓間充質(zhì)細胞治療四肢骨折骨不連，且取得良好療效。相對于骨髓、臍帶MSCs，hUC-MSCs不表達與移植排斥相關(guān)的HLA DR，異體移植該細胞可產(chǎn)生較好的免疫耐受性[7,8]，不但具有外源基因轉(zhuǎn)染和表達的優(yōu)點，而且具有免疫調(diào)節(jié)作用，可有效降低GVHD的發(fā)生率及嚴重程度[9]。另外，hUC-MSCs供應(yīng)充足，能實現(xiàn)無痛性收集及快速培養(yǎng)擴增等突出優(yōu)點，其得以在臨床上得到推廣和使用，而個別hUC-MSCs可選擇性地分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，具有更強的成骨潛力[10]。本研究采用hUC-MSCs移植，hUC-MSCs總數(shù)>50×107個，高于歐洲臍血移植協(xié)作組(Eurocord)2006年推薦的臍血細胞數(shù)量[11]。本研究顯示，治療后愈合評分高于治療前，且達到良好愈合者多。本組中個別患者愈合時間稍長，我們分析原因是hUC-MSCs在分離、提純、培養(yǎng)及濃縮等過程中的諸多因素與骨折愈合關(guān)系較為密切，另外許多技術(shù)及個體差別的因素，如炎癥、固定不牢及成骨障礙、復(fù)位不良等也可影響hUC-MSCs的治療效果。

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(收稿日期:2015-09-16)

doi：岑畢文，吳亞鵬，楊棋，尚暉，郭振鵬(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北十堰 442000)10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.044