高原反應(yīng)是指短期內(nèi)由平原進(jìn)入高原，或由低海拔地區(qū)進(jìn)入到高海拔地區(qū)時(shí)，由于對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)能力不全或失調(diào)而發(fā)生腦肺綜合征[1]。正常人進(jìn)入高原后，會(huì)因?yàn)楦咴蛪旱脱醯沫h(huán)境而導(dǎo)致缺氧，會(huì)出現(xiàn)頭痛、頭暈、心悸、胸悶、睡眠障礙、惡心、嘔吐等臨床癥狀。這些高原反應(yīng)嚴(yán)重影響了正常人的工作和生活，更嚴(yán)重影響了我軍行軍速度與作戰(zhàn)能力[2]。因此，積極采取措施預(yù)防和治療機(jī)體缺氧，對(duì)高原反應(yīng)的防治有舉足輕重的作用。國(guó)外常使用利尿藥、腎上腺皮質(zhì)激素、醋氮酰胺等藥物防治高原病，但療效不理想，且有一定的不良反應(yīng)[3-4]。中藥大多由天然植物組成，安全性較好，近年來(lái)中藥用于急性高原反應(yīng)防治的研究也有了很大的進(jìn)展。本研究的 “抗高原病方”是由8味中藥材組成，是根據(jù)經(jīng)典名方“丹參飲”經(jīng)過(guò)幾代中醫(yī)的臨床經(jīng)驗(yàn)，在實(shí)踐中不斷改進(jìn)的中藥復(fù)方。此藥方中丹參具有活血化瘀，養(yǎng)血安神的功效，為君藥；三七助丹參活血化瘀，西洋參益氣養(yǎng)陰，紅花活血定痛，共為臣藥；砂仁、檀香行氣止痛，山楂消食和胃，共為佐藥；冰片開(kāi)竅醒腦，并引諸藥上達(dá)顛頂，以止頭痛，為使藥。本研究通過(guò)小鼠密閉缺氧實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)抗高原病方的抗缺氧能力及其機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明小鼠（KM小鼠），SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2018-0010。恒溫、恒濕標(biāo)準(zhǔn)條件下飼喂、自由飲水并自動(dòng)控制晝夜節(jié)律。

1.1.2 藥物與試劑 抗高原病方由空軍特色醫(yī)學(xué)中心自制國(guó)，紅景天購(gòu)自四川省佳匯泰生物科技開(kāi)發(fā)有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒（20190510）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒（20190327）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測(cè)試盒（20190321）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）測(cè)試盒（20190304）、過(guò)氧化氫（H2O2）測(cè)試盒（20190516）、乳酸（lactic acid，LD）測(cè)試盒（20190522）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.3 儀器 小鼠密閉缺氧瓶（裝有約5 g鈉石灰的125 ml廣口瓶以橡皮塞密閉，空軍特色醫(yī)學(xué)中心自制）；PL-203電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KH-Ⅲ全自動(dòng)研磨儀和MX-F渦旋混合器均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；JY92-Ⅱn 超聲細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心 機(jī)購(gòu)自力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；Epoch酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 密閉缺氧實(shí)驗(yàn) 將72只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分成6組，各組灌胃給藥1次/d。對(duì)照組及缺氧模型組給予等體積生理鹽水，紅景天組劑量為0.078 g/（kg·d），抗高原病方低、中、高劑量分別為0.78 g/kg、1.56 g/kg、3.12 g/kg。連續(xù)給藥15 d后，除對(duì)照組外將其余小鼠單個(gè)置于裝有約5 g鈉石灰的125 ml廣口瓶中，以橡皮塞密閉，密切觀察記錄動(dòng)物死亡時(shí)間。依照實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組動(dòng)物存活時(shí)間（min），并對(duì)組間結(jié)果進(jìn)行方差分析。

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 完成缺氧密閉實(shí)驗(yàn)后，取小鼠腦組織和心臟組織，置-80 ℃冰箱中保存。將組織樣本制成10%組織勻漿，運(yùn)用試劑盒檢測(cè)組織中MDA、LD、H2O2、SOD、GSH-Px、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和CAT的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗高原病方對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響分別在第1、8、15天測(cè)定小鼠的體質(zhì)量，結(jié)果顯示各組小鼠體質(zhì)量均呈增加趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，抗高原病方低、中、高劑量組對(duì)小鼠體質(zhì)量均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而紅景天組小鼠體質(zhì)量均增加（P＜0.05）（表1）。

表1 抗高原病方對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（n=12）

2.2 抗高原病方對(duì)小鼠抗缺氧能力的影響與缺氧模型組比較，紅景天組小鼠存活時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而抗高原病方低、中、高劑量組小鼠存活時(shí)間增加，小鼠存活時(shí)間分別增加了14.45%、21.62%、44.84%，表明抗高原病方能夠顯著提高小鼠抗缺氧能力；與紅景天組比較，抗高原病方低、中、高劑量組小鼠存活時(shí)間增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明抗高原病方抗缺氧能力顯著優(yōu)于紅景天（表2）。

表2 抗高原病方對(duì)小鼠在密閉缺氧條件下存活時(shí)間的影響（n=12）

2.3 抗高原病方對(duì)缺氧小鼠心臟和腦組織中MDA、GSH-Px和SOD的影響與對(duì)照組比較，缺氧模型組、紅景天組和抗高原病方組小鼠心臟組織中MDA水平均顯著升高，并在抗高原病組中隨著給藥劑量的增加而不斷增加；同時(shí)GSH-Px和SOD的含量也增加（P＜0.05）。與缺氧模型組比較，紅景天組和抗高原病方中、高劑量組小鼠心臟組織中MDA的含量顯著增加，GSH-Px和SOD的含量?jī)H在抗高原病方組中顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。與對(duì)照組比較，缺氧模型組、紅景天組和抗高原病方組小鼠腦組織中MDA水平均顯著升高，并且抗高原病方組中MDA的含量隨著抗高原病方的劑量的增加而降低；小鼠腦組織中GSHPx的含量?jī)H在抗高原病方低、中劑量組以及紅景天組顯著增加，而SOD的含量在抗缺氧模型組、紅景天組以及抗高原病方低、中劑量組顯著增加。與缺氧模型組比較，紅景天組和抗高原病方組小鼠腦組織中MDA的含量均顯著增加，GSH-Px的含量在抗高原病方低、中劑量組以及紅景天組顯著增加，而SOD的含量?jī)H在抗高原病方低、中劑量組顯著增加（表4）。

表3 抗高原病方對(duì)小鼠心臟組織中MDA、GSH-Px和SOD的影響（n=12）

表4 抗高原病方對(duì)小鼠腦組織中MDA、GSH-Px和SOD的影響（n=12）

2.4 抗高原病方對(duì)缺氧小鼠心臟和腦組織中H2O2和CAT的影響與對(duì)照組比較，缺氧模型組、紅景天組和抗高原病方組小鼠心臟組織中H2O2水平均升高（P＜0.05），而CAT的含量在抗高原病方組中升高。與缺氧模型組比較，小鼠腦組織中CAT的含量在紅景天組和抗高原病方高劑量組中顯著升高，而H2O2的水平有一定程度的升高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）。

表5 抗高原病方對(duì)小鼠心臟組織中H2O2和CAT的影響（n=12）

與缺氧模型組比較，小鼠腦組織中H2O2的含量在缺氧模型組、紅景天組和抗高原病方組中較對(duì)照組均升高，并且在抗高原病方組中其含量隨著抗高原病方的劑量的增加而降低；而CAT的含量?jī)H在缺氧模型組中升高；與缺氧模型組比較，H2O2的含量在抗高原病方低劑量組中顯著升高（P＜0.01），CAT的含量在紅景天組和抗高原病方中、高劑量組中降低（P＜0.05）（表6）。

表6 抗高原病方對(duì)小鼠腦組織中H2O2和CAT的影響（n=12）

2.5 抗高原病方對(duì)缺氧小鼠心臟和腦組織中LD和LDH的影響與對(duì)照組比較，乳酸的含量?jī)H在抗高原病方高劑量組小鼠心臟組織以及抗高原病方低劑量組腦組織中升高（P＜0.05），與缺氧模型組比較，乳酸的含量?jī)H在抗高原病方低劑量組中顯著升高（P＜0.01），而乳酸脫氫酶僅在小鼠腦組織中檢測(cè)到，且僅在紅景天組中升高（P＜0.05）（表7）。

表7 抗高原病方對(duì)小鼠心臟和腦組織中LD和LDH的影響（n=12）

3 討論

高原環(huán)境的特點(diǎn)是低壓缺氧，未經(jīng)習(xí)服人員快速?gòu)钠皆M(jìn)入高原地區(qū)時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)頭痛、惡心、腸胃不適、睡眠不佳等急性高原病癥狀[5]。急性高原病是危害急進(jìn)高原人群健康的常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為高原腦水腫，危及生命[6]。目前，乙酰唑胺是目前國(guó)際上公認(rèn)預(yù)防急性高原病的藥物，是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的該適應(yīng)證的唯一藥物[7]，但由于其可引起四肢及面部麻木感、嗜睡、多尿、口渴、耳鳴和胃腸道不適等，甚至導(dǎo)致腎衰等不良反應(yīng)，限制其廣泛使用[8]。因此，積極研究尋找新的高效、安全的預(yù)防急性高原病的藥物是當(dāng)前高原醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。本研究中抗高原病方是根據(jù)經(jīng)典名方“丹參飲”經(jīng)過(guò)幾代中醫(yī)的臨床經(jīng)驗(yàn)，在實(shí)踐中不斷改進(jìn)，經(jīng)過(guò)理論研究的可行藥方。本研究通過(guò)小鼠密閉缺氧實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗高原病方能夠劑量依賴性地顯著延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，其作用顯著優(yōu)于紅景天，表明抗高原病方確實(shí)能夠增強(qiáng)小鼠的抗缺氧能力。

低壓缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)機(jī)體多個(gè)器官造成損傷，特別是腦組織[9]。大腦組織耗氧量大，含有高濃度的不飽和脂肪酸以及豐富的金屬離子，同時(shí)抗氧化酶的含量較低，這些因素使其對(duì)高原缺氧造成的氧化應(yīng)激非常敏感[10-11]。有研究表明，低壓缺氧條件下會(huì)嚴(yán)重影響腦組織結(jié)構(gòu)和功能，特別是神經(jīng)認(rèn)知功能和空間記憶能力[11-14]。雖然低壓低氧導(dǎo)致腦損傷的機(jī)制尚不完全明確，但是目前公認(rèn)過(guò)度的反應(yīng)氧蓄積是造成損傷的最重要原因之一。因此，該研究中對(duì)抗高原病方對(duì)小鼠心臟以及腦組織中MDA、H2O2、GSHPx、SOD和CAT氧化應(yīng)激等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)揭示其改善小鼠抗缺氧能力的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，在缺氧條件下，小鼠心臟以及腦組織中氧化應(yīng)激的標(biāo)志物丙二醛的含量顯著增加，表明當(dāng)小鼠暴露于低氧條件下心臟和腦組織的氧化應(yīng)激明顯增加，并且隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，這一結(jié)果與其他研究一致[15-17]。同時(shí)隨著氧化應(yīng)激水平的提高，小鼠心臟和腦組織中抗氧化酶（例如SOD和GSH-Px的含量也顯著增加，尤其抗高原病方能夠急劇增加心臟組織中SOD的含量。此外，本研究發(fā)現(xiàn)隨著缺氧會(huì)導(dǎo)致心臟和腦組織中H2O2的積累，但隨著抗高原病方劑量的增加H2O2的含量而逐漸降低。因此推斷抗高原病方可通過(guò)改善缺氧所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激生成和抗氧化劑保護(hù)之間的不平衡，從而降低對(duì)生物分子的氧化損傷，進(jìn)而提高小鼠的抗缺氧能力。

大腦作為機(jī)體代謝最活躍的器官，對(duì)缺氧更加敏感，該研究中缺氧條件下小鼠腦組織中乳酸和乳酸脫氫酶的含量顯著增加，說(shuō)明腦組織中糖酵解作用增強(qiáng)，有氧氧化過(guò)程受抑制，能量供應(yīng)障礙[17]，而抗高原病方隨著劑量的增加其抗缺氧能力增加，同時(shí)會(huì)改善LD及LDH在腦組織中的積累。

綜上所述，該研究證明了抗高原病方能夠顯著提高小鼠的抗缺氧效能，其作用主要是通過(guò)改善缺氧所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷和抗氧化保護(hù)之間的平衡，激活其抗氧化防御能力，對(duì)氧化應(yīng)激做出有效的適應(yīng)性反應(yīng)，同時(shí)改善機(jī)體在缺氧條件下能量的代謝障礙。