閔　彥，王　燕，胡成進

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ANCA相關(guān)性血管炎的實驗室診斷及研究進展

閔彥，王燕，胡成進

［關(guān)鍵詞］ANCA相關(guān)性血管炎;蛋白酶3;髓過氧化物酶;實驗室診斷

［作者單位］250031濟南，濟南軍區(qū)總醫(yī)院實驗診斷科

1　血管炎的分類

血管炎是一組異質(zhì)性疾病，均以血管壁炎癥為主要表現(xiàn)。目前已經(jīng)認識的系統(tǒng)性血管炎至少有20種。血管炎首先按受累血管的大小進行分類，包括小血管(毛細血管和毛細血管后微靜脈)、中等血管(肌性動脈和小動脈)和大血管(主動脈及其主要分支)。韋格納肉芽腫(肉芽腫性多血管炎)(GPA)、顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)及Churg-Strauss綜合征(嗜酸細胞肉芽腫性多血管炎) (EGPA)是一組累及小至中等血管并具有一些相同臨床、病理和實驗室特征的血管炎?？怪行粤＜毎麧{抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)是診斷以上3種小血管炎的有效工具［1］。

2　ANCA相關(guān)性血管炎的實驗室檢測

ANCA的靶抗原有10余種，與臨床最相關(guān)的是蛋白酶3 (PR3)和髓過氧化物酶(MPO)，兩者與ANCA相關(guān)血管炎及這些疾病的腎臟表現(xiàn)密切相關(guān)［2］。2012年CHCC命名會議認為，臨床上對血管炎患者分類，需要包括抗原的特異性以及血管炎的臨床病理表型，比如說，是PR3-MPA，還是MPO-MPA［3］。間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)聯(lián)合應(yīng)用是檢測ANCA相關(guān)血管炎的最佳方法。對臨床疑診為ANCA相關(guān)性血管炎的患者建議進行ANCA測定，并針對抗PR3抗MPO特異性抗體進行檢測［2］。

用IIF檢測乙醇固定的中性粒細胞共有3種熒光模型。(1)c-ANCA，是彌散的胞漿熒光顆粒，在90%活動性的GPA中陽性。其靶抗原主要是PR3。其他靶抗原包括殺菌/通透性增高蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)等。(2)p-ANCA，是一種中性粒細胞核周的染色，主要見于MPA和EGPA。其靶抗原主要是MPO。其他靶抗原包括乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)、溶酶體(lysozyme，LYS)、組織蛋白酶G(cathepsin G，Cath G)、BPI等。(3)非典型ANCA，即AANCA。A-ANCA比較少見，主要是同時胞漿染色和核周染色，或者是細胞核染色，具有多種抗原的特異性。A-ANCA主要和藥物暴露、關(guān)節(jié)炎或者類風濕病相關(guān)，很少見于血管炎。其靶抗原目前尚不清楚，LF、LYS、BPI都有報道，但無統(tǒng)一結(jié)論［4-5］。

用乙醇固定的中性粒細胞檢測ANCA易受到抗核抗體的干擾，用甲醛固定的中性粒細胞檢測ANCA可以排除這種干擾。Lin等［6］研究表明，中性粒細胞的雙基質(zhì)片(用乙醇和甲醛分別固定中性粒細胞)可以更好的辨別標本是否是ANCA陽性。中性粒細胞的雙基質(zhì)固定是用IIF檢測ANCA的重要策略之一。

抗MPO抗體陽性強烈提示壞死性血管炎或特發(fā)性新月體型腎小球腎炎(NCGN)。64%的壞死性NCGN患者可檢測出抗MPO抗體，MPA患者陽性率為60%，EGPA患者陽性率為50%，GPA患者陽性率為24%。除EGPA病例外，上述病例的大部分MPO陰性患者都可檢出抗PR3抗體陽性。MPO-ANCA在10%～15%的SLE中存在，可能與慢性炎癥有關(guān)，如動脈炎、漿膜炎和C-反應(yīng)蛋白增高。抗PR3抗體在臨床上與GPA密切相關(guān)。敏感性取決于疾病的活動性和病期階段，在初發(fā)不活動的GPA中，陽性率只有50%，而在活動性典型性GPA中，幾乎100%陽性。PR3-ANCA在其他原發(fā)性血管炎中也可被檢測到，如MPA、NCGN等［7］。

除了系統(tǒng)性血管炎外，ANCA在炎癥性腸病和自身免疫性肝病的診斷和鑒別診斷過程中也具有重要意義［7］。pANCA與炎性腸病(IBD)相關(guān)。IBD包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩(Crohn disease，CD)2種疾病。pANCA在UC患者血清中陽性率為60%～80%，而在CD患者中陽性率為10%～20%［5］。此外，ANCA在原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)的陽性率為60%～80%，在原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的陽性率為30%，ANCA還與自身免疫性肝炎(AIH)相關(guān)。

3　ANCA相關(guān)性血管炎檢測技術(shù)研究進展

3．1間接免疫熒光法的成像分析系統(tǒng)雖然有很多可替代的篩查方法出現(xiàn)，對于用ANCA篩查血管炎，IIF仍然是推薦的方法。但是，這種方法的可信性取決于很多因素，包括底物、酶及閱片人的經(jīng)驗等。為了解決這些問題，以計算機為基礎(chǔ)的間接免疫熒光法的成像分析系統(tǒng)已經(jīng)開始應(yīng)用于ANCA的檢測。ANCA的IIF成像分析系統(tǒng)有很多優(yōu)勢:如節(jié)約標本和試劑，縮短檢測時間等。有些檢測系統(tǒng)已經(jīng)商業(yè)化，它們可以檢測有無ANCA的存在，并且可能區(qū)分特別的熒光模式。

AKLIDES(Medipan GmbH，Germany)是一種IIF成像分析系統(tǒng)。這種系統(tǒng)可以分析熒光的強度，并且在結(jié)合乙醇染色和甲醛染色的基礎(chǔ)上，分析基本的ANCA模型。Knutter等［8］研究表明，這種自動熒光分析系統(tǒng)與人工分析相比，在區(qū)分是否是ANCA方面高度一致，在結(jié)合乙醇和甲醛染色的基礎(chǔ)上，可以較好的判斷熒光模型。但是，在判讀胞漿和非典型ANCA時，這種自動判讀系統(tǒng)的敏感性，不及人工［8］。Damoiseaux小組［9］研究也表明，自動判讀系統(tǒng)識別PR3-ANCA陽性(乙醇固定)的AAV時，敏感性較人工低。但它對甲醛染色C-ANCA識別較好。對于MPO-ANCA陽性的血清，自動判讀系統(tǒng)對乙醇固定中性粒細胞的P-ANCA識別較好，但對甲醛固定中性粒細胞的C-ANCA模型識別較差。與人工相比，在ANA存在的情況下，這種自動分析系統(tǒng)區(qū)分AANCA及P-ANCA比較困難［9］。因為ANCA的熒光模型預(yù)示著ANCA抗原的特異性，因此，自動識別系統(tǒng)需要在識別乙醇固定中性粒細胞熒光模型方面優(yōu)化［4］。

CytoBead技術(shù)是一種結(jié)合細胞和磁珠的數(shù)字化IIF分析技術(shù)，可同時進行ANCA初篩和確認實驗。Sowa等人研究表明，CytoBead技術(shù)所確認的PR3-ANCA，MPO-ANCA，P-ANCA，C-ANCA，與經(jīng)典的ANCA分析法具有一致性，兩者沒有明顯的差異。CytoBead技術(shù)具有多重分析功能，可同時進行初篩以及確認實驗，是一種使用自動數(shù)字化IIF的快速有效的ANCA分析技術(shù)［10］。間接免疫熒光法的自動識別系統(tǒng)對于ANCA的篩查是一個具有前景的技術(shù)。但是，在臨床應(yīng)用之前，還需要進一步的改進和多中心對它的評估。

3．2特異性抗原的免疫測試傳統(tǒng)的直接ELISA是將抗原直接包被在固體板上，而捕獲式ELISA及錨定式ELISA都將抗原固定在單克隆抗體或“橋分子”上。抗原特異性的捕獲式ELISA可用來檢測PR3-ANCA和MPO-ANCA。錨定式ELISA主要是檢測PR3-ANCA。捕獲式ELISA或錨定式ELISA法與IIF相結(jié)合，可最大程度提高AAV患者血清的檢測敏感性。因為抗原特異性的捕獲式ELISA和錨定式ELISA檢測PR3-ANCA與MPO-ANCA具有更好的可操作性，所以，很多學者對目前ANCA相關(guān)血管炎的實驗室診斷流程發(fā)出質(zhì)疑，建議先以ELISA作為第一步的初篩實驗，再以IIF進行確證實驗［4］。在稍早些的研究中，Russell［11］就提出了類似的建議。Russell等在常規(guī)實驗室的檢測條件下，比較了標準化IIF、MPO直接ELISA以及PR3捕獲式ELISA的檢測效率。結(jié)果表明，PR3-ANCA以及MPO-ANCA聯(lián)合檢測具有最好的敏感性，用IIF檢測的C-ANCA具有最好的特異性。Russell提出，為了保持最大的診斷準確性，并節(jié)約人工勞動，可以先用ELISA進行初篩，再用IIF進行確認。這種新的流程有待于多中心的聯(lián)合驗證，以確認是否是一種具有更好敏感性和特異性的檢測方法［12］。

3．3其他的免疫學檢測方法包括免疫印跡法、側(cè)向?qū)游龇?、基于流式細胞術(shù)的磁珠法及電化學發(fā)光法測定。De Joode等人研究表明，印跡法與ELISA一樣，可迅速檢測ANCA和抗腎小球基底膜抗體，有利于提高血管炎患者的檢出率，是有力的快速診斷工具［13］。Damoiseaux等［14］研究發(fā)現(xiàn)Europlus ANCA Biochip(印跡法膜條)對ANCA相關(guān)血管炎的診斷敏感性和特異性，與IIF及ELISA法的聯(lián)合應(yīng)用具有一致性。免疫印跡法屬于定性測定，結(jié)果最終還需用ELISA法的定量測定。Offermann小組［15］證實了側(cè)向?qū)游龇z測PR3及MPO的抗體，與ELISA法的檢測結(jié)果，有很好的一致性。側(cè)向?qū)游龇ǖ膬?yōu)點在于經(jīng)濟，特別有利于早期和準確診斷。而基于流式細胞術(shù)的磁珠法測定特異性不及聯(lián)合應(yīng)用IIF和ELISA法，敏感性與IIF類似，比ELISA法敏感性更強一些，特異性與ELISA法類似［16］。此外，電化學發(fā)光法也用于檢測PR3和MPO兩種抗體。Mahler等［17-18］進行的一項大型多中心的研究表明，電化學檢測法具有更好的動力學范圍，更完整的線性稀釋曲線及更好的批間和批內(nèi)精密度。與現(xiàn)有的ELISA試劑盒相比，電化學發(fā)光法檢測PR3和MPO抗體的敏感性和特異性具有一致性。

4　ANCA對臨床診斷的意義

ANCA檢測只是臨床診斷的輔助手段，必須結(jié)合患者的病史、影像學及臨床癥狀來診斷，血管炎的組織學檢測是金標準，每個待檢患者都需要做這方面的檢測［4］。ANCA在監(jiān)測疾病活動性、指導對AAV患者的處理方面的作用，仍然是有爭議的。北京協(xié)和醫(yī)院診療常規(guī)認為，PR3-ANCA抗體滴度與病情活動一致，在GPA等原發(fā)性血管炎患者，常被作為判斷療效、估計復發(fā)的指標，從而指導臨床治療。但Tomasson等［19］所做的meta分析表明，ANCA在監(jiān)測疾病復發(fā)方面的作用很有限。在隨訪的AAV患者中，ANCA滴度的上升，并不伴隨著病情的復發(fā)。醫(yī)生可能更傾向于通過尿常規(guī)來監(jiān)測病情的復發(fā)。通過捕獲式或錨定式ELISA檢測來監(jiān)測AAV的復發(fā)，還需更好地研究才能應(yīng)用于臨床［5，19］。

總之ANCA相關(guān)性血管炎的實驗室診斷具有重要的作用，但必須結(jié)合患者的病史加以分析，才能更好的服務(wù)于臨床診斷和治療。新發(fā)展的ANCA診斷技術(shù)，包括以計算機成像技術(shù)為基礎(chǔ)的IIF識別系統(tǒng)，錨定式或捕獲式的ELISA，都具有較好的發(fā)展前景。以計算機成像技術(shù)為基礎(chǔ)的IIF識別系統(tǒng)有可能在將來取代人工閱片。但最終的ANCA檢測報告，還需要有資質(zhì)的實驗室人員進行確認。錨定式或捕獲式的ELISA有可能取代IIF成為一種ANCA的初篩方法?？焖贆z測PR3和MPO抗體的檢測方法包括印跡法、電化學發(fā)光法等，有利于快速診斷復發(fā)的血管炎患者并對其進行處理，以防止疾病的惡化和腎衰的出現(xiàn)。

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(本文編輯:林永麗)

(收稿日期:2015－06－06)

［中圖分類號］R34

［文獻標識碼］A［DOI］10．3969/j．issn．1009－0754．2016．01．037