張　蕾　薛永飛　任中海

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科，河南　南陽(yáng)　473000)

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三氧化二砷聯(lián)合塞來(lái)昔布對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用

張蕾薛永飛任中海

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科，河南南陽(yáng)473000)

摘要〔〕目的探討三氧化二砷(As2O3)聯(lián)合塞來(lái)昔布(celecoxib)對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。方法以上皮性卵巢癌細(xì)胞株(OVCAR-3)為研究對(duì)象，As2O3、celecoxib及兩藥聯(lián)合作用于細(xì)胞株48 h后，噻唑藍(lán)(MTT)法體外檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用，并采用金正均q值法計(jì)算聯(lián)合用藥的q值。采用凋亡染色和流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期影響，蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡)檢測(cè)Bcl-2和caspase-3凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果As2O3和celecoxib對(duì)OVCAR-3細(xì)胞呈劑量依賴(lài)性的生長(zhǎng)抑制作用，As2O3的半數(shù)抑制濃度(IC50)為4.00 μmol/L，celecoxib的IC50為40.00 μmol/L；As2O3和celecoxib聯(lián)合用藥后，OVCAR-3細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率均大于單藥作用組(P<0.05)，聯(lián)合用藥的q值>1.15，有顯著的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。 As2O3和celecoxib聯(lián)合用藥后OVCAR-3細(xì)胞發(fā)生明顯的G2/M期阻滯，Bc1-2表達(dá)明顯下調(diào)，而caspase-3表達(dá)則明顯上調(diào)(P< 0.05)。結(jié)論As2O3和celecoxib單藥對(duì)OVCAR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，聯(lián)合用藥具有顯著的協(xié)同作用。As2O3和celecoxib聯(lián)合用藥對(duì)于上皮性卵巢癌的藥物治療有重要的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞〔〕卵巢癌;三氧化二砷;塞來(lái)昔布;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

第一作者：張蕾(1978-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科方面的研究。

上皮性卵巢癌近年呈上升趨勢(shì)，死亡率居首位〔1〕。卵巢癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是造成卵巢癌治療困難的主要原因〔2〕。三氧化二砷(As2O3)對(duì)卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等各種實(shí)體瘤有較強(qiáng)的治療作用，其機(jī)制主要為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、提高細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)水平、抑制核因子、清除腫瘤干細(xì)胞等〔3，4〕。塞來(lái)昔布(celecoxib)是環(huán)氧合酶-2抑制劑靶向藥物，具有抗感染與抗腫瘤作用。celecoxib的抗腫瘤機(jī)制為對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)雙重效應(yīng)。celecoxib對(duì)卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞均具有增殖抑制作用〔5～7〕。臨床試驗(yàn)顯示，As2O3單藥對(duì)實(shí)體瘤療效有限，與其他化療藥物聯(lián)合使用則顯示出可觀的療效〔8〕。本研究以上皮性卵巢癌細(xì)胞株(OVCAR-3)為研究對(duì)象，探討As2O3聯(lián)合celecoxib對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑OVCAR-3由中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈(zèng)。1640培養(yǎng)液購(gòu)自天津?？谍埞荆ヅＱ?FBS)購(gòu)自天津?？谍埞?。亞砷酸注射液(主要成分為As2O3和NaCl)購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司，Celecoxib標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自白廣州優(yōu)瓦儀器有限公司，純度99.5%)。胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT),二甲基亞砜(DMSO)等(購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)，B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2),半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(caspase-3)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)鼠抗人單克隆抗體、羊抗鼠IgG等(購(gòu)自美國(guó)BD公司)，丙烯酞胺、十二烷基磺酸鈉和聚偏二氟乙烯膜(PDVF)等(購(gòu)自美國(guó)Amresco公司)。蛋白提取試劑盒和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)。高倍顯微鏡(美國(guó) Leica-M841 型)，高速冷凍離心機(jī)(美國(guó) Heal Force)，流式細(xì)胞儀(FCM)(美國(guó) Accuri)，快速溫度梯度PCR儀(美國(guó) Bio-RAD)，熒光定量PCR反應(yīng)機(jī)(美國(guó) Agilent)，瓊脂糖電泳儀(美國(guó) Bio-RAD)，酶聯(lián)免疫儀(美國(guó) BioTek)，37℃ CO2培養(yǎng)箱(上海新苗)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇OVCAR-3細(xì)胞用含10% FBS的640培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。隔日換液。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3～4 d用0.25%胰酶消化并按1∶2傳代。

1.3藥物干預(yù)及MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整濃度至每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種至96 孔板中，細(xì)胞貼壁后，常規(guī)培養(yǎng)24 h，用含不同濃度藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。藥物干預(yù)方法為As2O3、celecoxib及兩藥聯(lián)合三組。As2O3組等比設(shè)置1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μmol/L 6個(gè)濃度，celecoxib組等差設(shè)置10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100 μmol/L 6個(gè)藥物濃度，兩藥聯(lián)合組設(shè)置1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celecoxib、2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L celecoxib以及4.00 μmol/L As2O3+ 40.00 μmol/L celecoxib三組。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置空白組，且每孔最終反應(yīng)體系中DMSO的濃度均小于0.03%。48 h 后，每孔加 MTT 20 μl，繼續(xù)孵育 4 h后小心吸棄上清液，每孔加入150 μl的DMSO，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)，細(xì)胞存活率(M)=藥物組A值/空白組A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率(E)=〔1-M/(陰性對(duì)照組A值-空白組A值)〕×100%。單藥實(shí)驗(yàn)中，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，計(jì)算各藥物作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)。按金正均q值法公式〔q=E(a+b)/(Ea+Eb)-Ea×Eb〕計(jì)算(a為As2O3，b為celecoxib)，評(píng)價(jià)兩種藥物聯(lián)合的協(xié)同或拮抗效應(yīng)，q值為0.85～1.15時(shí)，兩藥合呈單純相加效應(yīng)，q>1.15時(shí)，兩藥合用具有協(xié)同效應(yīng)，q<0.85時(shí)，兩藥具有拮抗效應(yīng)。

1.4凋亡染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取培養(yǎng)的單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞約為1.5×105，根據(jù)細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)染色步驟進(jìn)行細(xì)胞染色，事先進(jìn)行染色分組，設(shè)置好空白組，EP管中加入As2O3、celecoxib及兩藥聯(lián)合藥液。用錫箔紙包裹避光放入37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，取出后以2 000 r/min離心5 min，棄上清，沖洗后加入50 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)后按分組進(jìn)行Hoechest33258染色，避光在4℃環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)15 min，倒置熒光顯微鏡下觀察單藥及聯(lián)合作用的細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征，包括細(xì)胞體積縮小、核固縮、染色質(zhì)邊集和凋亡小體形成等。

1.5FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期分布OVCAR-3培養(yǎng)24 h后以單藥及二者聯(lián)合用藥處理細(xì)胞48 h，并設(shè)陰性對(duì)照。收集細(xì)胞，PBS洗滌，用預(yù)冷的70%乙醇溶液固定，離心5 min，再用1% 無(wú)DNA酶活性的RNA酶(NAase)和碘化丙啶(PI)染液處理，F(xiàn)CM檢測(cè)凋亡率及細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)單藥以及兩藥聯(lián)合作用48 h后，常規(guī)方法提取總蛋白。設(shè)立陰性對(duì)照組。行十二烷基硫酶鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫3% FBS封閉60 min，加入白蛋白稀釋的Bcl-2、caspase-3、β-actin抗體，輕搖過(guò)夜，TBST(Tris-Hcl,NaCl,tween20)漂洗4次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG反應(yīng)60 min，TBST漂洗4次，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑反應(yīng)3 min。以目的蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參條帶的灰度值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)，IC50值的計(jì)算采用概率單位法。

2結(jié)果

2.1對(duì)OVCAR-3細(xì)胞增殖的抑制作用MTT結(jié)果顯示，1.00 μmol/L As2O3和10.00 μmol/L celecoxib對(duì)OVCAR-3細(xì)胞的抑制作用不明顯，分別為(5.2±0.9)%、(5.4±0.6)%(P>0.05)，16.00 μmol/L As2O3〔(86.7±2.3)%〕、32.00 μmol/L As2O3〔(88.9±2.4)%〕、80.00 μmol/L celecoxib〔(81.1±1.9)%〕、100.00 μmol/L celecoxib〔(83.2±1.9)%〕以及4.00 μmol/L As2O3+40.00 μmol/L celecoxib〔(90.4±2.3)%〕、1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celeooxib〔(56.7±1.7)%〕、2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L cellcoxib〔(89.3±2.1)%〕對(duì)OVCAR-3細(xì)胞的抑制作用減弱(P<0.05)。2.00、4.00、8.00 μmol/L As2O3〔(15.1±1.31)%、(49.5±1.4)%、(83.7±2.1)%〕和20.00、40.00、60.00 μmol/L celecoxib〔(13.7±1.5)%、(50.6±1.2)%、(68.9±1.8)%〕對(duì)OVCAR-3細(xì)胞均具有顯著的劑量依賴(lài)性抑制作用(P<0.05)，As2O3的IC50值為4.00 μmol/L，celecoxib的IC50為40.00 μmol/L；As2O3聯(lián)合celecoxib后，OVCAR-3細(xì)胞的增殖抑制率均高于同濃度As2O3和celecoxib單藥的抑制率(P<0.05)。其中1.00 μmol/L As2O3為11.24%，2.00 μmol/L As2O3為15.1%，10.00 μmol/L celecoxib為8.76%，20.00 μmol/L celecoxib為13.7%，1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celecoxib為56.7%，2.00 μmol/L As2O3+ 20.00 μmol/L celecoxib為89.3%。1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celecoxib聯(lián)合用藥的q值為2.83，2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L celecoxib聯(lián)合用藥的q值為3.08。As2O3和celecoxib兩藥聯(lián)合作用對(duì)OVCAR-3細(xì)胞具有顯著的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

2.2對(duì)OVCAR-3細(xì)胞凋亡的影響OVCAR-3細(xì)胞經(jīng)不同濃度的As2O3和celecoxib作用后，均能觀察到細(xì)胞體積縮小、核固縮、染色質(zhì)邊集以及凋亡小體形成等細(xì)胞凋亡。As2O3和celecoxib兩藥聯(lián)合后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于As2O3和celecoxib單藥組。FCM結(jié)果顯示，As2O3和celecoxib單藥組VCAR-3細(xì)胞凋亡率均呈藥物濃度依賴(lài)性改變。2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L celecoxib聯(lián)合用藥后OVCAR-3細(xì)胞凋亡率最嚴(yán)重(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　單藥以及兩藥聯(lián)合對(duì)OVCAR-3細(xì)胞凋亡的影響

與空白組比較:1)P<0.05；與任一單藥比較:2)P<0.05

2.3對(duì)OVCAR-3細(xì)胞周期的阻滯作用FCM結(jié)果顯示，OVCAR-3細(xì)胞分別經(jīng)As2O3和celecoxib單獨(dú)處理后，細(xì)胞周期G1和S的影響不明顯(P>0.05)，而對(duì)細(xì)胞周期G2/M阻滯明顯(P<0.05)。2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L celecoxib聯(lián)合用藥后OVCAR-3細(xì)胞周期G2/M阻滯最明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.4對(duì)OVCAR-3細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western印跡OVCAR-3細(xì)胞經(jīng)2.00 μmol/L As2O3和40 μmol/L celecoxib單藥及1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celecoxib聯(lián)合作用后，與空白組Bcl-2 0.97,caspase-3 0.85比較，聯(lián)合用藥組的凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，分別為0.57，0.52，0.28；而激活型蛋白caspase-3的表達(dá)水平上調(diào)，分別為1.42，1.57，2.34(P<0.05)。

3討論

上皮性卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤之一，目前以手術(shù)加化療為主要治療手段?；熢谏掀ば月殉舶┑闹委熤芯哂信e足輕重的地位。國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道，celecoxib與As2O3聯(lián)合用藥對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病原代細(xì)胞融合蛋白的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有協(xié)同抑制作用〔9〕。一般化療藥和抗代謝藥物與celecoxib聯(lián)合應(yīng)用在如膀膚癌、肝癌和卵巢癌中有報(bào)道且療效較好〔4，5，10〕。

As2O3和celecoxib聯(lián)合用藥的協(xié)同機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制有關(guān)，為驗(yàn)證其作用機(jī)制，結(jié)果表明，熒光顯微鏡凋亡染色顯示As2O3和celecoxib兩藥聯(lián)合后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于As2O3和celecoxib單藥組。通過(guò)研究有力證明了在上皮性卵巢癌細(xì)胞中As2O3和celecoxib聯(lián)合用藥協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

細(xì)胞凋亡與Bcl-2蛋白密不可分，Bcl-2為抗凋亡蛋白，細(xì)胞凋亡時(shí)Bcl-2表達(dá)受到抑制，線(xiàn)粒體膜通透性被破壞，細(xì)胞色素C等釋放〔11〕。活化caspase-3切割底物使細(xì)胞發(fā)生凋亡。活化的caspase-3是級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分〔12〕。提示As2O3和celecoxib聯(lián)合用藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)線(xiàn)粒體凋亡通路起到了重要作用。

綜上，As2O3和celecoxib單藥對(duì)OVCAR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，聯(lián)合用藥具有顯著的協(xié)同作用。As2O3和celecoxib聯(lián)合用藥對(duì)于上皮性卵巢癌的藥物治療有重要的應(yīng)用前景。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：任中海(1968-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科方面的研究。

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R737.31〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6059-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.023