林巧妹　王偉林

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科,浙江　杭州　321000)

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肝細(xì)胞癌中脯氨酸羥化酶1、2、3的表達(dá)及其臨床意義

林巧妹1王偉林

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科,浙江杭州321000)

摘要〔〕目的探討肝細(xì)胞癌(HCC)中脯氨酸羥化酶(PHD)1、PHD2、PHD3的表達(dá)及臨床意義。方法運(yùn)用組織芯片技術(shù),通過(guò)免疫組織化學(xué)Envision法檢測(cè)103例HCC和14例癌旁肝組織、13例正常組織中PHD1、PHD2和PHD3的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理因素進(jìn)行分析。結(jié)果PHD1在HCC中表達(dá)明顯高于正常肝組織(P<0.05),而 PHD2在HCC中表達(dá)明顯低于正常肝組織(P<0.05),PHD3在HCC中表達(dá)明顯高于癌旁肝組織及正常肝組織(P<0.05)。PHD1表達(dá)與HCC分化程度、脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期和術(shù)后3年生存率顯著相關(guān)(P<0.05)；PHD2表達(dá)與HCC分化程度、TNM分期、包膜侵犯和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)；PHD3表達(dá)與肝細(xì)胞癌分化程度、脈管內(nèi)瘤栓和術(shù)后3年生存率顯著相關(guān)(P<0.05)。PHD1與PHD3呈正相關(guān)(r=0.274,P=0.001)。生存分析顯示PHD1、PHD3陽(yáng)性表達(dá)患者生存期較陰性表達(dá)患者明顯縮短(P<0.05)。COX多因素分析顯示PHD3表達(dá)是HCC的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論P(yáng)HD1、PHD2和PHD3在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起著不同程度的作用，聯(lián)合檢測(cè)PHD1、PHD2和PHD3可能有助于判斷HCC的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后分析。

關(guān)鍵詞〔〕 肝細(xì)胞癌；脯氨酸羥化酶；缺氧誘導(dǎo)因子；預(yù)后

1麗水市中心醫(yī)院普外科

第一作者：林巧妹(1982-)，女，醫(yī)師，碩士，主要從事普外科研究。

肝細(xì)胞癌(HCC)作為實(shí)體腫瘤，常因生長(zhǎng)較快易出現(xiàn)缺氧，低氧可激活細(xì)胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1，后者通過(guò)調(diào)節(jié)多種靶基因表達(dá)刺激腫瘤新生血管形成、維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔1〕。因此HIF-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而脯氨酸羥化酶(PHD) 是調(diào)控HIF-1的關(guān)鍵分子，通過(guò)催化HIF的脯氨酸殘基發(fā)生羥基化反應(yīng)介導(dǎo)其降解，是全過(guò)程的限速酶〔2〕。至今發(fā)現(xiàn)的脯氨酸羥化酶家族(PHDs)有PHD1、PHD2、PHD3、PHD4四種〔3,4〕，以前三種研究較多，但關(guān)于PHDs在肝癌中的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)HCC中PHD1、PHD2、PHD3的表達(dá)，分析其與臨床病理因素的關(guān)系，探討其在HCC發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的作用。

1材料與方法

1.1臨床材料收集麗水市中心醫(yī)院2005年12月至2010年12月手術(shù)切除HCC標(biāo)本103例，全組病人均隨訪至2013年4月，臨床資料和隨訪資料完整?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行放、化療和免疫治療。14例癌旁肝組織選自距HCC邊緣2 cm以上的癌旁肝組織。另取13例經(jīng)病理證實(shí)的正常肝組織(取自肝破裂或肝內(nèi)膽管結(jié)石行肝切除標(biāo)本)。103例HCC中男85例，女18例；年齡37～87(平均61)歲；有脈管瘤栓23例；肝癌最大徑>5 cm有26例；高分化(Edmonson分級(jí)1～2) 39例，低分化(Edmonson分級(jí)3～4)64例；TNM分期Ⅰ和Ⅱ期80例，Ⅲ和Ⅳ期23例；術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移43例。

1.2組織芯片制作在相應(yīng)的蠟塊上選定有代表性的區(qū)域并作標(biāo)記,參照Konomen等創(chuàng)建的方法,用自制組織芯片制作工具在一新的空白受體蠟塊上穿孔(直徑1.8 mm),再用相同內(nèi)徑的空心管從選取的供體蠟塊中穿取組織,準(zhǔn)確放入空白蠟塊的小孔內(nèi),依次按序操作,直至將所有組織標(biāo)本種植于空白蠟塊中。每例取腫瘤1處。再用同法取14例癌旁肝組織及13例正常肝組織標(biāo)本種植于空白蠟塊中制作組織芯片。

1.3方法采用免疫組織化學(xué)技術(shù)Envision法,組織芯片4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化后，采用高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)。兔抗人PHD1和PHD2單克隆抗體、兔抗人PHD3多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。PHD1、PHD2、PHD3抗體的工作液濃度分別為1∶150、1∶50、1∶200。抗原經(jīng)pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液高壓鍋煮沸修復(fù)處理，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色過(guò)程。最后鏡下控制DAB 顯色,蘇木素復(fù)染和中性樹(shù)膠封固。每次染色均用pH 7.2～7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液代替一抗作陰性對(duì)照,用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定PHD1陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，小部分細(xì)胞核中也有表達(dá)；PHD2陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)；PHD3陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，以胞核為主。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，觀察腫瘤細(xì)胞或肝細(xì)胞的染色強(qiáng)度及比例。采用二級(jí)計(jì)分法,首先按染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。再按相應(yīng)物鏡下陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞<10%，2分為10%～50%，3分為>50%～75%，4分為>75%。上述兩種得分的乘積為綜合免疫組化評(píng)分：≤3分為陰性，>3分為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較用Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸模型進(jìn)行，PHD1～PHD3在HCC組織中表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1組織芯片質(zhì)量組織芯片排列整齊，共取材130例，實(shí)際有效130例，有效率100%。

2.2HCC和癌旁組織、正常肝組織中PHD1、PHD2與PHD3蛋白的表達(dá)比較PHD1在HCC中主要表達(dá)于胞質(zhì)，小部分胞核中也有表達(dá)，與癌旁肝組織(57.1%)、正常肝組織(23.1%)比較，HCC中高表達(dá)(圖1)，陽(yáng)性表達(dá)率為71.8%。PHD1在HCC中表達(dá)明顯高于正常肝組織(χ2=12.301，P<0.05)。PHD2在HCC中主要表達(dá)于胞質(zhì)，與癌旁肝組織(78.6%)、正常肝組織(84.6%)比較，HCC呈低表達(dá)(圖1)，陽(yáng)性表達(dá)率為56.3%。PHD2在HCC中表達(dá)明顯低于正常肝組織(χ2=3.840，P<0.05)。PHD3在HCC中主要表達(dá)于胞質(zhì)和胞核，以胞核為主，與癌旁肝組織(28.6%)、正常肝組織(15.4%)比較，HCC高表達(dá)(見(jiàn)圖1)，陽(yáng)性表達(dá)率為63.1%。PHD3在HCC中表達(dá)明顯高于癌旁組織(χ2=6.076，P<0.05)及正常肝組織(χ2=10.775，P<0.05)。

2.3PHD1、PHD2和PHD3的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系PHD1表達(dá)與HCC分化程度、脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期和術(shù)后3年生存率顯著相關(guān)(P<0.05)；PHD2表達(dá)與HCC分化程度、TNM分期、包膜侵犯和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)；PHD3表達(dá)與HCC分化程度、脈管內(nèi)瘤栓和術(shù)后3年生存率顯著相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4PHD1、PHD2和PHD3表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，PHD1和PHD3在HCC中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.274，P=0.001)。而PHD2與PHD1、PHD3間無(wú)相關(guān)性。

2.5PHDs表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系PHD1、PHD3表達(dá)與HCC術(shù)后病人生存有關(guān)，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，PHD1、PHD3陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)組生存時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.415，P=0.020；χ2=4.007，P=0.045)，PHD1、PHD3陽(yáng)性表達(dá)組生存時(shí)間較短。但PHD2表達(dá)與HCC患者生存無(wú)關(guān)。采用逐步回歸法進(jìn)行COX比例模型多因素分析，結(jié)果顯示PHD3表達(dá)、脈管瘤栓、TNM分期是HCC的獨(dú)立預(yù)后因素。見(jiàn)圖2。

表1HCC不同臨床特征中PHD1、PHD2和PHD3蛋白表達(dá)的比較〔n(%)〕

病理特征nPHD1陽(yáng)性χ2值P值PHD2陽(yáng)性χ2值P值PHD3陽(yáng)性χ2值P值腫瘤大小(cm) ≤57738(49.4)2.0080.15622(28.6)2.7170.09932(41.6)0.5630.453 >52617(65.4)12(46.2)13(50.0)分化程度 高分化3916(41.0)3.8610.0498(20.5)4.4330.03510(25.6)8.3110.004 低分化6439(60.9)26(40.6)35(54.7)脈管內(nèi)瘤栓 無(wú)8036(45.0)10.1540.00125(31.3)0.5020.47930(37.5)5.5790.018 有2319(82.6)9(39.1)15(65.2)TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期8037(46.3)7.3560.00720(25.0)10.3940.00132(40.0)1.9820.159 Ⅲ+Ⅳ期2318(78.3)14(60.9)13(56.5)包膜侵犯 無(wú)4924(49.0)0.7330.39211(22.4)4.7140.03020(40.8)0.3140.575 有5431(57.4)23(42.6)25(46.3)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移 無(wú)6032(53.3)0.0000.98812(20.0)11.0000.00126(43.3)0.0070.931 有4323(53.5)22(51.2)19(44.2)術(shù)后生存時(shí)間(個(gè)月) <364838(79.2)23.9870.00014(29.2)0.6000.43831(64.6)15.9510.000 ≥365517(30.9)20(36.4)14(25.5)

PHD1

PHD3

圖1HCC中PHD1、PHD2、PHD3陽(yáng)性表達(dá)(Envision,×400)

圖2　PHD1、PHD 2、PHD 3表達(dá)與HCC術(shù)后病人生存時(shí)間的比較(生存曲線)

3討論

PHDs是一種重要的氧感受器，通過(guò)催化脯氨酸殘基羥基化來(lái)介導(dǎo)HIF降解，是調(diào)節(jié)HIF水平和轉(zhuǎn)錄活性、維持氧穩(wěn)態(tài)的重要酶類，它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。PHD1～3在不同類型的正常組織和腫瘤中表達(dá)水平、分布有差別〔5〕，且PHD的不同亞型在血管生成、腫瘤形成、細(xì)胞生長(zhǎng)分化存活等病理生理過(guò)程中發(fā)揮不同作用〔6〕。PHDs在許多腫瘤細(xì)胞中都有不同程度的表達(dá)，如頭頸部鱗癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等〔7,8〕。腫瘤常因生長(zhǎng)快出現(xiàn)缺氧微環(huán)境，低氧時(shí)PHD活性降低，對(duì)HIF降解減少，導(dǎo)致HIF大量積聚，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、內(nèi)皮素-1、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白加氧酶(Glu)-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-α等基因表達(dá)，這些產(chǎn)物參與腫瘤細(xì)胞代謝、血管擴(kuò)張、新血管生成等過(guò)程〔7〕。

本研究提示PHD1與惡性腫瘤細(xì)胞侵襲性密切相關(guān)，PHD1可能通過(guò)對(duì)腫瘤形成后的生長(zhǎng)及血行轉(zhuǎn)移起作用，其高表達(dá)可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。PHD1在一定程度上影響HCC術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)、生存時(shí)間。但在小鼠異種移植實(shí)驗(yàn)中，增加PHD1的表達(dá)可以抑制HIF的穩(wěn)定、減少VEGF的分泌，使微血管生成減少，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)〔9〕，可能PHD家族成員在不同類型腫瘤中及控制腫瘤生長(zhǎng)方面的功能有所不同，有待進(jìn)一步研究。

PHD2是降解HIF-1α的主要酶類，缺氧時(shí)PHD2活性降低，導(dǎo)致HIF大量積聚，編碼VEGF增多，刺激內(nèi)皮細(xì)胞脫離臨近血管向刺激處遷移并增殖，形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)，該過(guò)程即血管生成，新的血管生成后有利于腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移〔10〕。本研究結(jié)果顯示PHD2在HCC組織中陽(yáng)性率顯著低于正常肝組織，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王照紅等〔11〕報(bào)道基本一致，即HCC組織中PHD2表達(dá)降低，可引起血管的大量新生及異常分化，向HCC提供豐富的血供及生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)提示PHD2在低分化、有包膜侵犯、存在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的HCC患者中高表達(dá)，證實(shí)PHD2與HCC的侵襲性轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。沈文狀等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)PHD2表達(dá)水平與HCC的Edmondson分級(jí)相關(guān)，而與腫瘤直徑和是否有轉(zhuǎn)移或者血管侵犯無(wú)明顯關(guān)系，說(shuō)明腫瘤存在異質(zhì)性。有研究表明PHD2是人胃癌一個(gè)較強(qiáng)的預(yù)后指標(biāo)〔13〕。

本研究提示，HCC組織中PHD3的表達(dá)水平可能對(duì)HCC的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，并有可能成為預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的新指標(biāo)。Hogel等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，缺氧為腫瘤細(xì)胞選擇出那些在低氧環(huán)境下生存能力強(qiáng)且具有高度侵襲性的細(xì)胞，使腫瘤更富侵襲性，而PHD3是PHD家族成員中缺氧上調(diào)能力最強(qiáng)的亞型；增加頭頸部鱗癌組織PHD3表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期、增強(qiáng)缺氧下癌細(xì)胞的存活，而特異性抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞PHD3的表達(dá)可減少細(xì)胞在缺氧情況下的存活，說(shuō)明PHD3與腫瘤的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果還顯示PHD1與PHD3呈正相關(guān)，可能機(jī)制是：①缺氧環(huán)境下Siah2對(duì) PHD1 和 PHD3的泛素途徑依賴的降解作用增強(qiáng)，繼而導(dǎo)致HIF-1α累積，而Siah2對(duì) PHD2作用不顯著〔15〕。②活性轉(zhuǎn)錄因子(ATF)4可正調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)，而ATF4可與PHD1、PHD3相互作用，而與PHD2無(wú)明顯相互作用，所以PHD1和PHD3對(duì)ATF4的作用可影響腫瘤血管生成及腫瘤的生長(zhǎng)〔16〕。本研究還發(fā)現(xiàn)PHD2與PHD1、PHD3無(wú)明顯相關(guān)，這可能與PHD家族各個(gè)成員間作用復(fù)雜、受多種因素調(diào)節(jié)有關(guān)。如有研究表明,當(dāng)PHDs調(diào)節(jié)HIF-α蛋白穩(wěn)定性的同時(shí)，PHD2和PHD3自身又受到來(lái)自HIFs的反饋性向上調(diào)節(jié)〔6〕。PHD2是在常氧情況下在大多數(shù)細(xì)胞中數(shù)量最多的亞型，在常氧及弱的缺氧時(shí)對(duì)HIF-1α起主要調(diào)節(jié)作用；而PHD3是在嚴(yán)重且持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間缺氧情況下調(diào)節(jié)HIF〔5，17〕。

PHDs作為調(diào)節(jié)HIFs的關(guān)鍵酶，促使細(xì)胞的功能適應(yīng)低氧的環(huán)境，對(duì)維持腫瘤細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中的生存、血管生成、侵襲浸潤(rùn)是至關(guān)重要的。因此，以PHD為靶點(diǎn)治療HCC是一種十分有前景的治療策略。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)通過(guò)檢測(cè)PHDs的表達(dá)將有助于判斷HCC的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后分析，為HCC的靶向治療提供了新思路。

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〔2014-06-24修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者：王偉林(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肝膽胰外科研究。

中圖分類號(hào)〔〕R735.7〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6834-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.086