董坤+常靜+祖可佳+王欣欣+劉暉+馮驥良+呂福東

[摘要] 目的 探討磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）及ki67在不同分化程度的肝細(xì)胞癌（HCC）中的表達(dá)強(qiáng)度，分析不同分化程度的肝細(xì)胞癌組織中GPC3的表達(dá)強(qiáng)度與ki67之間的關(guān)系。 方法 搜集2010年7月～2014年7月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院病理科90例HCC部分肝切除標(biāo)本。采用免疫組化SP法檢測HCC中GPC3及ki67的表達(dá)情況，比較不同分化程度的HCC中GPC3及ki67表達(dá)的強(qiáng)度，分析不同分化程度HCC中GPC3表達(dá)情況與ki67之間的關(guān)系。 結(jié)果 低分化HCC中GPC3的陽性率（90.00%）明顯高于中分化（83.33%）和高分化（50.00%），且中分化明顯高于高分化，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；GPC3中-強(qiáng)著色度（+++～++++）在低分化HCC中陽性率（66.67%）高于中分化（23.33%）及高分化中（6.67%），且中分化明顯高于高分化，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；低分化HCC中ki67的表達(dá)高于中分化和高分化，且中分化高于高分化，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；不同分化HCC中GPC3的表達(dá)與ki67呈正相關(guān)（r = 0.551，P = 0.000）。 結(jié)論 GPC3、ki67的表達(dá)強(qiáng)度與HCC的分化有關(guān)；GPC3的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的ki67表達(dá)呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞癌；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；ki67；分化程度

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）10（b）-0023-05

Analysis of expression of Glypican-3 and ki67 in different grade of hepatocellular carcinoma

DONG Kun CHANG Jing ZU Kejia WANG Xinxin LIU Hui FENG Jiliang LU Fudong

Department of Pathology， Beijing You'an Hospital， Capital Medical University， Beijing 100069， China

[Abstract] Objective To investigate the expression intensity of Glypican-3 （GPC3） and ki67 in different grade hepatocellular carcinoma （HCC）， and analyze the relationship between the expression of GPC3 and ki67 in different grade HCC. Methods From July 2010 to July 2014， in Department of Pathology， Beijing You'an Hospital， Capital Medical University， 90 samples of HCC hepatectomies were selected. GPC3 and ki67 were detected by immunohistochemistry SP method， the expression intensity of GPC3 and ki67 in different grade HCC were compared， the correlation of GPC3 and ki67 in different grade HCC was analyzed. Results The positive expression rate of poorly differentiated HCC （90.00%） was significantly higher than that of intermediate differentiated HCC （83.33%） and well differentiated HCC （50.00%）， and this of intermediate differentiated HCC was significantly higher than that of well differentiated HCC， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Middle to strong staining intensity positive expression rate of GPC3 in poorly differentiated HCC （66.67%） was higher than that of intermediate differentiated HCC （23.33%） and well differentiated HCC （6.67%）， that of intermediate differentiated HCC was significantly higher than that of well differentiated HCC， the differences were statistically significant （P < 0.01）. The ki67 exeression of poorly differentiated HCC was higher than that of intermediate differentiated HCC and well differentiated HCC， and this of intermediate differentiated HCC was significantly higher than that of well differentiated HCC， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Strength of the expression of GPC3 had positive correlation with the expression of ki67 （r = 0.551， P = 0.000）. Conclusion The expression of GPC3 and ki67 have correlation with the differentiation of HCC. GPC3 has positive correlation with the expression of ki67.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Glypican-3； Ki67； Differentiated grade

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在男性癌癥中排名第5位（523 000例/年，所有癌癥中占7.9%），在女性癌癥中排名第7位（226 000例/年，所有癌癥中占6.5%）[1]。臨床初篩HCC首選肝臟超聲及血清甲胎蛋白（AFP）檢測，有肝硬化的患者血清AFP>200 ng/mL時強(qiáng)烈提示HCC可能，但并不是所有HCC患者的AFP水平都會升高，而且AFP升高并不單純出現(xiàn)在HCC中[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，無論血清中還是組織中AFP的敏感性及特異性均不高[3]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）是近年來比較熱門的一種用于肝細(xì)胞癌診斷的標(biāo)志物，因其敏感性好，特異性高，被認(rèn)為可能是一種新型癌胚因子[4]。GPC3在胚胎肝臟中表達(dá)豐富，但是在成人正常肝臟中無表達(dá)[5]。有研究發(fā)現(xiàn)GPC3在HCC中表達(dá)的敏感性為68%～72%，特異性為92%[1]。但是GPC3在不同分化程度的HCC中敏感性差異的研究較少。ki67作為腫瘤細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，常用于即時反映腫瘤增殖細(xì)胞的數(shù)量，判斷腫瘤的惡性程度及預(yù)后[6]。本研究的目的是通過對不同分化程度的肝細(xì)胞癌組織中GPC3和ki67表達(dá)的情況進(jìn)行分析，研究GPC3在不同分化程度的HCC中表達(dá)的強(qiáng)度，同時研究不同分化程度的HCC中GPC3和ki67的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

收集2010年7月～2014年7月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院病理科的HCC部分肝切除標(biāo)本共90例，其中高分化30例，中分化30例，低分化30例。

1.2 材料和試劑

GPC3， ki67抗體及二抗PV6000均購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

所有標(biāo)本先經(jīng)過10%的甲醛固定后，取材，按脫水、透明、浸蠟、包埋程序處理，4 μm連續(xù)切片，之后進(jìn)行HE染色，肝癌病理診斷經(jīng)2名副主任以上醫(yī)師復(fù)診。HCC的鏡下分級采用WHO推薦HCC分級標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.3.1 染色方法 采用EnVision兩步法，上述切片經(jīng)烤片、脫蠟，梯度乙醇由高至低入水，入3%過氧化氫5 min，PBS緩沖液浸透3次，每次5 min，放入pH 6.0檸檬酸緩沖液中高溫高壓修復(fù)：高壓鍋噴氣后，加熱2 min，變中火2 min，關(guān)火后燜10 min，放入冷水中冷卻至37℃，之后入PBS緩沖液洗3次，加GPC3一抗（鼠抗人單克隆抗體），4℃冰箱過夜，PBS緩沖液浸3次，每次5 min，加二抗PV6000（通用型抗體）37℃10 min，PBS緩沖液浸3次，DAB顯色，PBS液終止染色，甲醛逐級由低至高濃度脫水至入二甲苯，封片。ki67染色步驟同GPC3。

1.3.2 判斷方法 ki67染色位于細(xì)胞核，免疫組化診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色為陽性；每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野（400×），每個視野數(shù)100個細(xì)胞， 按陽性細(xì)胞所占百分比評分：診斷分級為≤5%，>5%～30%，>30%～50%，>50%。GPC3染色位于胞漿及細(xì)胞膜。免疫組化診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色為陽性；每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野（400×），每個視野數(shù)100個細(xì)胞， 按陽性細(xì)胞所占百分比評分：“-”：<5%的腫瘤細(xì)胞著色；“1”：5%～25%的腫瘤細(xì)胞著色；“2”：>25%～50%的腫瘤細(xì)胞著色；“3”：>50%～75%的腫瘤細(xì)胞著色；“4”：>75%的腫瘤細(xì)胞著色；其次染色強(qiáng)度評分：不著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。最后將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占百分比計分乘積作為每例染色的綜合評分，0分為（-），1～2分為（+），3～5分為（++），6～9分為（+++），≥10分為（++++）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 90例患者一般資料情況

90例患者，年齡38～84歲，平均（53.7±0.1）歲；男68例，女22例；HBsAg陽性66例，陰性24例；腫瘤直徑≤5 cm者46例，>5 cm者44例；腫瘤單發(fā)者74例，多發(fā)者16例；伴腫瘤壞死者30例，無腫瘤壞死者60例；伴脈管內(nèi)癌栓者18例，無脈管內(nèi)癌栓者72例；有肝硬化背景者56例，無肝硬化背景者34例。GPC3的表達(dá)強(qiáng)度與患者的年齡、性別、HBsAg陽性與否、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤壞死、脈管內(nèi)癌栓及肝硬化無關(guān)（P > 0.05）。見表1。

2.2 不同分化程度的HCC HE組織染色

高分化HCC顯示細(xì)胞輕度異型，肝板結(jié)構(gòu)紊亂，可見腫瘤細(xì)胞假腺樣排列（圖1A，封三）；中分化HCC顯示腫瘤細(xì)胞中度異型，核漿比增加，腫瘤細(xì)胞呈假腺樣或細(xì)梁狀排列（圖1B，封三）；低分化HCC顯示腫瘤細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核大，核膜不規(guī)則，可見核仁，腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)巢狀或?qū)嵭云瑺钆帕校▓D1C，封三）。

2.3 GPC3在高、中、低分化HCC組織中的表達(dá)

GPC3在HCC中的著色在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，大部分肝細(xì)胞癌是混合著色，HCC分化越低，GPC3著色越強(qiáng)（圖2，封三）。不同分化的HCC組織中GPC3表達(dá)的強(qiáng)度及陽性率性況具體見表2。高分化的HCC中GPC3陽性率為50.00%，其中“+～++”陽性率為43.33%，“+++～++++”陽性率為6.67%；中分化的HCC中陽性率均為83.33%，其中“+～++”陽性率為60.00%， “+++～+++++”陽性率為23.33%；低分化的HCC中陽性率為90.00%，其中“+～++”陽性率為23.30%，“+++～++++”陽性率為66.67%。統(tǒng)計結(jié)果顯示：GPC3在低分化的HCC中的陽性率明顯高于中分化及高分化，并且中分化高于高分化，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。低分化組中GPC3的強(qiáng)陽性（+++～++++）率明顯高于中分化及高分化，并且中分化明顯高于高分化，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。說明GPC3的表達(dá)與HCC的分化程度有關(guān)。