楊靜+++++張建軍++++++鐘森

[摘要] 目的 研究中藥雄黃主要成分As2S2對人肝癌細(xì)胞株QGY-77 03增值和凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法 2012年9月—2013年4月，分析不同濃度的As2S2處理QGY-7703細(xì)胞后，MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測PCNA的表達(dá)情況。結(jié)果 較低濃度（7.5 mg/L）的As2S2對QGY-7703細(xì)胞的生長無影響；15～120 mg/L的As2S2可抑制細(xì)胞的生長，具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性（P<0.01）。As2S2在15～30 mg/L范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡率隨濃度和作用時(shí)間增加而增加（P<0.01）；60 mg/L組凋亡率比低濃度組低，表現(xiàn)為繼發(fā)性壞死細(xì)胞增多。As2S2處理組可明顯降低PCNA蛋白的陽性表達(dá)（P<0.01）。 結(jié)論 As2S2在一定的濃度范圍內(nèi)可以誘導(dǎo)QGY-7703細(xì)胞發(fā)生凋亡，通過下調(diào)PCNA的表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖，隨著作用時(shí)間的延長和（或）濃度的提高，As2S2表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死。

[關(guān)鍵詞] 雄黃；肝細(xì)胞癌；凋亡

[中圖分類號(hào)] R736 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2015）01（b）-0012-02

Effects of Realgar on the Proliferation and Apoptosis of Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line QGY-7703

YANG Jing1 ZHANG Jianjun2 ZHONG Sen3

1.Department of Infectious Diseases， Yaan People's Hospital， Yaan， Sichuan Province， 625000， China；

2.Department of Infectious Diseases， The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College， Luzhou， Sichuan Province， 646000， China；

3.Department of Hepatopathy， Teaching Hospital of Chengdu University of T.C.M， Chengdu， Sichuan Province， 610072， China

[Abstract] Objective To study the effect of realgar main component As2S2 on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line QGY-7703 and the possible mechanism. Methods From September 2012 to April 2013 QGY-7703 cell was treated by different concentrations of As2S2 first， then the cell proliferation inhibition rate of QGY-7703 cell was detected by MTT method； the cell apoptosis was tested by flow cytometry； the expression of PCNA was detected by immunocytochemistry method. Results As2S2 at low concentration（7.5mg/L） had no effect on the growth of QGY-7703 cells； As2S2 with the concentration of 15mg/L～120mg/L could inhibit the growth of QGY-7703 cells， the inhibitory rate depended on the concentration and time （P<0.01）. As2S2 with the concentration of 15 mg/L～30 mg/L， the cell apoptotic rate increased with the increase of concentration and action time （P<0.01）. The cell apoptotic rate of 60 mg/L group was lower than those of low concentration groups， and the secondary necrotic cells increased. The positive expression level of PCNA protein of As2S2 group decreased significantly（P<0.01）. Conclusion As2S2 in a certain range of concentration can induce the apoptosis of QGY-7703 cells， inhibit the proliferation of the cells by down-regulation of the expression of PCNA. And as the longer duration of action and（or） the increase of the concentration， As2S2 showed certain cytotoxic effect， promoting tumor cell necrosis.

[Key words] Realgar； Hepatocellular carcinoma； Apoptosis

雄黃的主要成分為As2S2，具有解毒殺蟲、燥濕祛痰、截瘧的功效[1]，常用來治療癰腫療瘡、蛇蟲咬傷、蟲積腹痛、驚癇和瘧疾等疾病。近年來，As2O3在白血病的治療中療效顯著，已被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的研究和臨床治療。作為毒性更小的含砷化合物，雄黃及其復(fù)方制劑在白血病治療中也取得了可喜的成績[2]，其抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制的研究也越來越深入[3]。但有關(guān)雄黃對實(shí)體瘤的報(bào)道較少。自2012年9月—2013年4月，該實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞株QGY-7703細(xì)胞為研究對象，探討雄黃的主要成分As2S2對肝癌細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

As2S2（純度98%）購自美國Sigma公司，配制方法參照文獻(xiàn)4，RPMI 1640袋裝培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青生物公司，DMSO及MTT購自美國Amresco公司，AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒購自美國Beckman公司，鼠抗人PCNA單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。人肝癌細(xì)胞株QGY-7703由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株QGY-7703常規(guī)復(fù)蘇后用含10%新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液中分別含有青霉素、鏈霉素各100 U/mL。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法觀察As2S2對肝癌細(xì)胞株增殖的影響

將QGY-7703細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3.0×104 個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)（200 μL/孔），同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)組（不同濃度的As2S2處理）、對照組（不加藥物的細(xì)胞）和空白組（調(diào)零），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。次日細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組棄去培養(yǎng)液加不同濃度的As2S2，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入MTT液20 μL（5 g/L），于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處測定其吸光度（A）值，按公式計(jì)算：細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值）×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察As2S2對肝癌細(xì)胞株凋亡的影響

胰蛋白酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，以1.0×105 個(gè)/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)（2.5 mL/孔）。次日細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度As2S2的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)48 h、72 h后，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分別加入Annexin V （FITC標(biāo)記） 5 μL、PI 2.5 μL，避光冰上孵育10 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測PCNA的表達(dá)

胰蛋白酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，以4×104 個(gè)/mL的密度接種于預(yù)置玻片（經(jīng)多聚賴氨酸處理）的6孔培養(yǎng)板內(nèi)（2.5 mL/孔），置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。次日細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組棄去培養(yǎng)液，每孔重新加入含不同濃度As2S2的培養(yǎng)基2.5 mL，使As2S2終濃度分別為15 mg/L、30 mg/L。培養(yǎng)48 h后，取出玻片按SABC法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，按試劑盒說明書操作，PBS代替一抗作陰性對照。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單向方差分析（One-way ANOVA），各實(shí)驗(yàn)組與對照組間比較用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 As2S2對QGY-7703細(xì)胞增殖的影響

7.5 mg/L As2S2對QGY-7703細(xì)胞生長無影響（P>0.05）。15～120 mg/L的As2S2可抑制細(xì)胞的生長，且在此范圍內(nèi)抑制率隨著濃度增加而增加，具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。15 mg/L As2S2處理組作用24 h抑制率是（8.01±1.93）%，72 h達(dá)（59.93±4.63）%。而120 mg/L As2S2處理組作用24 h、72 h的抑制率分別是（43.10±1.79）%、（83.56±3.49）%。As2S2的濃度、作用時(shí)間和抑制率之間的關(guān)系見圖1。

圖1 不同濃度As2S2對QGY-7703細(xì)胞生長的抑制曲線

2.2 流式細(xì)胞儀檢測As2S2對QGY-7703細(xì)胞凋亡的影響

如表1所示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率呈不同程度上升，與此同時(shí)，活細(xì)胞數(shù)隨雄黃濃度增高而急劇下降。As2S2在15～30 mg/L范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡率隨濃度增加而增加，而繼發(fā)性壞死細(xì)胞比例也在增加。60 mg/L組出現(xiàn)細(xì)胞凋亡率較低濃度組減低，表現(xiàn)為繼發(fā)性壞死細(xì)胞增多。

表1 As2S2對QGY-7703細(xì)胞凋亡率的影響（x±s）

注：▲與對照組（0 mg/L）比較， P<0.01；○與對照組比較， P<0.05。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測As2S2對QGY-7703細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

PCNA蛋白陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞核。凡細(xì)胞核內(nèi)見有均勻一致分布的棕黃色顆粒，胞漿不著色者即為陽性細(xì)胞。As2S2處理組可明顯降低PCNA蛋白的陽性表達(dá)（見表2）。與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，預(yù)后差。以化療為主的綜合治療對于不能手術(shù)切除的肝癌仍是目前主要的治療手段。但由于傳統(tǒng)化療藥物存在副作用大、敏感性低、易產(chǎn)生多藥耐藥性等缺點(diǎn)而效果不佳，因此尋求新的有效的化療藥物對于肝癌的治療有重要意義。

近年來，雄黃在臨床上已成功用于白血病的治療，并開始應(yīng)用于抗其它血液系統(tǒng)惡性腫瘤及實(shí)體瘤的研究。龐琦等[5]建立膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，雄黃局部注射治療腫瘤，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)雄黃對肺腺癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞都有抑制增值并誘導(dǎo)凋亡的作用[6-10]。目前研究認(rèn)為雄黃抗腫瘤作用的機(jī)制可能為：①誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；②抑制腫瘤細(xì)胞增殖；③促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化；④抗腫瘤血管生成[3]。

張晨[11]報(bào)道，雄黃對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402有明顯細(xì)胞毒作用，不僅可抑制肝癌細(xì)胞的生長增殖，并且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)組中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的兩種蛋白Ap02.7和Fas均有表達(dá)增加的趨勢。黃姣娥等[12]報(bào)道雄黃對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的抗腫瘤作用機(jī)制與升高細(xì)胞內(nèi)鈣、降低細(xì)胞線粒體膜電位并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

該實(shí)驗(yàn)通過MTT法也觀察到相似的結(jié)果，在15～120 mg/L濃度范圍內(nèi)，As2S2能抑制QGY-7703細(xì)胞的生長，抑制作用隨著藥物濃度的提高、作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)，呈時(shí)效和量效關(guān)系。該研究免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)的QGY-7703細(xì)胞，PCNA陽性表達(dá)率較高，經(jīng)As2S2作用48 h后，PCNA的表達(dá)明顯下降，其降低程度與藥物濃度呈明顯的正相關(guān)。據(jù)此推測，As2S2抑制細(xì)胞增殖的可能機(jī)制之一是抑制了參與DNA合成的PCNA，從而導(dǎo)致DNA合成受阻，進(jìn)而抑制了細(xì)胞增殖。

該研究中，QGY-7703細(xì)胞的自發(fā)凋亡率較低，可部分解釋肝癌對放療敏感性較差這一現(xiàn)象。As2S2以15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L三個(gè)濃度分別作用于QGY-7703細(xì)胞48 h、72 h。與對照組比較，試驗(yàn)組QGY-7703細(xì)胞的凋亡率不同程度增加，但并非呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。隨著藥物濃度的提高和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率反而降低，表現(xiàn)為以繼發(fā)性壞死細(xì)胞為主。表明As2S2在一定的濃度范圍內(nèi)具有誘導(dǎo)QGY-7703細(xì)胞凋亡的作用，但隨著作用時(shí)間增加和濃度的提高則表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死。

該實(shí)驗(yàn)僅是雄黃對肝癌細(xì)胞作用的初步研究，因其未設(shè)陽性對照組，僅以一株肝癌細(xì)胞為研究對象，且尚未進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)的抑瘤實(shí)驗(yàn)，有待今后增加對肝癌細(xì)胞系的研究，并對其機(jī)制作進(jìn)一步深入探討。

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（收稿日期：2014-11-20）