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        葡萄籽原華青素對(duì)慢性間歇性低氧大鼠空間工作記憶和5-羥色胺的影響

        2016-01-29 08:20:00趙雅寧李建民
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2015年23期
        關(guān)鍵詞:工作記憶低氧皮質(zhì)

        喬 嬌 趙雅寧 李建民

        (河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 ,河北 唐山 063000)

        ?

        葡萄籽原華青素對(duì)慢性間歇性低氧大鼠空間工作記憶和5-羥色胺的影響

        喬嬌1趙雅寧李建民

        (河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 ,河北唐山063000)

        摘要〔〕目的探討葡萄籽原華青素(GSP)對(duì)慢性間歇性大鼠空間工作記憶和5-羥色胺(5-HT)的影響。方法80只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為:對(duì)照組、模型組、GSP低劑量組(100 mg/kg)、GSP高劑量組(200 mg/kg),每組20只。對(duì)照組暴露于空氣中,模型組暴露于低氧條件下(50 ml/L),暴露時(shí)間每天8 h,持續(xù)4 、8 w;應(yīng)用HE染色觀察腦組織形態(tài)變化;Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的空間記憶能力;用高效液相色譜法測(cè)定損傷大腦皮質(zhì)內(nèi)5-HT的含量。結(jié)果與對(duì)照組比較,模型組皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少,5-HT的含量明顯降低(P<0.05);水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示動(dòng)物潛伏期明顯延長(zhǎng),穿臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05)。與模型組比較,GSP組皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多,5-HT的含量明顯增多,水迷宮檢測(cè)動(dòng)物逃避潛伏期時(shí)間縮短、穿臺(tái)次數(shù)增多(P<0.05);上述變化在高劑量GSP組最為顯著(P<0.05)。結(jié)論GSP可增加5-HT的含量、改善間歇性低氧大鼠空間工作記憶能力。

        關(guān)鍵詞〔〕葡萄籽原華青素;間歇性低氧;5-羥色胺;空間工作記憶

        1四川省婦幼保健院

        第一作者:?jiǎn)虌?1982-),女,護(hù)師,碩士,主要從事急危重癥護(hù)理學(xué)和護(hù)理教育研究。

        工作記憶是指大腦對(duì)信息進(jìn)行短暫儲(chǔ)存及加工處理的過(guò)程;空間記憶是工作記憶的一種,是日常生活中最為重要的認(rèn)知功能之一,能幫助個(gè)體對(duì)周圍環(huán)境中的物體進(jìn)行定位或是學(xué)習(xí)路線〔1〕。阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS) 可造成患者記憶障礙以及出現(xiàn)執(zhí)行能力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)方面的認(rèn)知問(wèn)題〔2,3〕。5-羥色胺(5-HT)是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì),與許多功能調(diào)節(jié)有關(guān),諸如睡眠、性行為、情感行為以及學(xué)習(xí)和記憶等〔4〕。原花青素(GSP)是天然植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱,以葡萄籽中含量最為豐富。研究表明葡萄籽原花青素(GSP)具有抗氧化、清除自由基、心血管保護(hù)、降血脂、抗腫瘤等功能〔5,6〕,但目前有關(guān)GSP對(duì)睡眠呼吸暫停造成工作記憶的研究,少見報(bào)道。本研究采用濃度結(jié)合時(shí)間切換的方式模擬臨床睡眠呼吸暫停狀態(tài)的低氧,建立慢性間歇性缺氧模型,探討GSP對(duì)間歇性低氧大鼠空間記憶與5-HT的影響。

        1材料和方法

        1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器雄性SD大鼠80只(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物資源中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào):0127011),體質(zhì)量210~230 g;測(cè)氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠);低氧控制程序(河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)院呼吸科);純氮(唐山六方氣體高科技有限公司);低氧艙(天津醫(yī)科大學(xué)研制)。GSP由天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供;SABC試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

        1.2動(dòng)物分組和模型制備80只雄性SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組,高、低劑量GSP干預(yù)組,每組20只。模型組:模擬臨床呼吸暫停事件,建立OSAHS模式間歇低氧動(dòng)物模型:每天8:00am~4:00pm將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于模型艙內(nèi),向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)夂涂諝?,每次循環(huán)2 min,連續(xù)給予氮?dú)?0 s,維持艙內(nèi)氧濃度最低至5%(50 ml/L),隨后均復(fù)氧至氧濃度21%(210 ml/L)。對(duì)照組持續(xù)充入壓縮空氣。用數(shù)字測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)艙內(nèi)氧濃度變化,使艙內(nèi)氧濃度維持在各自的氧濃度內(nèi),使其氧濃度波動(dòng)范圍在±0.5%以內(nèi);每天實(shí)驗(yàn)8 h,實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為2 w和6 w。GSP組在動(dòng)物進(jìn)入低氧模型艙前2 w開始每天灌胃給藥1次,持續(xù)給藥8 w,高、低劑量分別為200、100 mg/kg。對(duì)照組暴露于正常空氣中;分別在實(shí)驗(yàn)第2周和第6周進(jìn)行所設(shè)指標(biāo)檢測(cè)。

        1.3腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察病理組織學(xué)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)4%多聚甲醛灌注固定后取腦,截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織,常規(guī)石蠟包埋。Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,片厚5 μm,蘇木伊紅染色(HE)染色。在有測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡(200×)下觀察額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化并計(jì)數(shù)該視野下的存活神經(jīng)元數(shù)量(有明顯細(xì)胞膜、細(xì)胞核、核仁為存活神經(jīng)細(xì)胞)。具體方法:將每個(gè)標(biāo)本取4張切片,在額葉皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)選取4個(gè)視野,在有測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡(200×)下觀察額葉皮質(zhì)區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞變化并計(jì)數(shù)(200×)倍視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,以每個(gè)視野下平均細(xì)胞百分率(200×下皮質(zhì)區(qū)存活細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量比值%)表示。

        1.4色譜柱檢測(cè)腦內(nèi)5-HTHPLC Column C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),保護(hù)柱DIKMA(4 mm×8 mm,5 μm)。柱溫20℃,流動(dòng)相選用檸檬酸、檸檬酸三鈉、甲醇-離子對(duì)試劑-EDTA-Na2混合液(pH4.2),經(jīng)過(guò)濾后梯度洗脫。取凍存大鼠腦皮層準(zhǔn)確稱重,用預(yù)冷的高氯酸(內(nèi)含0.15 μg/ml的DHBA)制備10%的組織勻漿,離心15 min,上清液過(guò)濾后取10 μl手動(dòng)進(jìn)樣,在上述色譜條件下,采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定5-HT含量以ng/g腦組織濕重表示,樣本處理液:0.01%半胱氨酸+0.2 mol/L高氯酸鈉+0.5 mmol/L EDTA。

        1.5記憶功能檢測(cè)Morris水迷宮是目前國(guó)內(nèi)外研究中廣泛應(yīng)用的檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶功能最精確、客觀的一種方法。實(shí)驗(yàn)時(shí),將安全島置于水迷宮第二象限中,加水至高過(guò)安全島2~3 cm,水溫保持在22℃~25℃,由攝像機(jī)及計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤、拍攝和統(tǒng)計(jì)大鼠分別由四個(gè)象限入水后尋找到安全島的軌跡、潛伏值和穿臺(tái)次數(shù)。如在90 s內(nèi)未找到安全島,則潛伏期值記為90 s。在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死前晨起訓(xùn)練5次后,分別在上午、下午各測(cè)試3次,共6次納入統(tǒng)計(jì),記錄各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間及撤去平臺(tái)后動(dòng)物穿越原平臺(tái)位置的次數(shù),取總均值。

        2結(jié)果

        2.1GSP對(duì)慢性間歇性低氧大鼠空間記憶能力的影響與對(duì)照組相比,模型組動(dòng)物的大鼠逃避潛伏期時(shí)間均延長(zhǎng)、穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)均減少;與模型組組比較,GSP組能顯著縮短大鼠逃避潛伏期時(shí)間、增加原平臺(tái)位置的次數(shù)(P<0.05)。見圖1,表1。

        2.2GSP對(duì)慢性間歇性低氧大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組大鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠在間歇性低氧2 w、6 w均可見變性壞死的神經(jīng)元,神經(jīng)細(xì)胞胞體收縮呈三角形,胞質(zhì)嗜色性減弱,核皺縮濃染,細(xì)胞周圍出現(xiàn)空隙;視野內(nèi)可見有核溶解及神經(jīng)元細(xì)胞空泡樣變,細(xì)胞間隙顯著增寬,存活神經(jīng)元密度均明顯減少(P<0.05);GSP組中皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷減輕,大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,存活神經(jīng)元細(xì)胞存活密度顯著增加(P<0.05)。見圖2。

        2.3GSP對(duì)慢性間歇性低氧腦組織5-HT含量的影響與對(duì)照組相比,模型組大鼠腦皮質(zhì)中5-HT含量顯著降低(P<0.05)。與模型組相比較,GSP組中腦組織5-HT含量都有不同程度升高(P<0.05)。見表2。

        圖1各組大鼠空間記憶能力表

        組別逃避潛伏期(s)2w6w穿臺(tái)次數(shù)2w6w對(duì)照組12.65±2.5512.21±2.6011.57±2.1810.94±2.40模型組36.84±11.351)44.20±4.661)4.62±1.251)3.10±0.921)低劑量GSP組28.93±9.481)2)36.04±4.951)2)5.81±1.601)2)6.32±1.121)2)高劑量GSP組20.76±2.021)2)3)22.86±3.181)2)3)7.68±1.611)2)3)9.22±1.181)2)3)

        與對(duì)照組比較:1)P<0.05,2)P<0.05;與低劑量GSP組比較:3)P<0.05,下表同

        圖2各組大鼠6 w后皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(HE,×400)

        組別存活神經(jīng)元密度(%)2w6w含量5-HT(ng/g)2w6w對(duì)照組99.4±0.699.2±0.844.2±8.5542.65±10.49模型組63.5±22.71)54.7±33.81)28.27±4.861)22.67±4.321)低劑量GSP組74.4±21.81)2)62.2±20.61)2)33.78±5.971)2)30.69±5.261)2)高劑量GSP組82.5±17.21)2)3)74.7±19.41)2)3)47.93±7.791)2)3)38.43±5.531)2)3)高劑量GSP組20.76±2.021)2)3)22.86±3.181)2)3)7.68±1.611)2)3)9.22±1.181)2)3)

        3討論

        工作記憶包括負(fù)責(zé)加工位置、距離等空間信息的視空間模板和處理語(yǔ)音方面的信息語(yǔ)音環(huán)路以及中央執(zhí)行系統(tǒng),其核心是系統(tǒng)位于前額葉〔7〕。神經(jīng)影像學(xué)顯示OSAHS患者大腦的多個(gè)部位和功能區(qū)受損如大腦皮質(zhì)灰質(zhì)丟失,海馬區(qū)在內(nèi)的腦實(shí)質(zhì)萎縮等;應(yīng)用事件相關(guān)電位事件評(píng)測(cè)睡眠呼吸暫?;颊?,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)信息加工事件電位N270電位(前額及枕部)波幅降低,患者工作記憶降低〔8,9〕。本研究結(jié)果顯示GSP可改善睡眠呼吸暫停模式低氧導(dǎo)致的工作記憶損傷。研究認(rèn)為睡眠呼吸暫停造成的間歇性低氧類似于缺血再灌注,可造成腦內(nèi)生成大量氧自由基,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、丟失,引起記憶功能損害〔10〕;而GSP抗氧化能力極強(qiáng),是維生素E(VitE)的50倍、VitC的20倍,與SOD相當(dāng)〔11〕,因此可改善睡眠呼吸暫停大鼠記憶能力,能增強(qiáng)其信息的獲取、加工及保持能力。

        5-HT是腦內(nèi)存在的一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),對(duì)記憶的調(diào)節(jié)以及腦功能的維持有重要作用。Mazer等〔12〕給成年大鼠腦中灌注酪氨酸羥化酶抑制劑-對(duì)氯苯丙氨酸以耗竭5-HT,結(jié)果出現(xiàn)大鼠學(xué)習(xí)能力缺損。學(xué)習(xí)記憶能力下降的大鼠其腦內(nèi)5-HT亦顯著降低〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)迷迭香對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有改善作用;且這種作用與腦內(nèi)5-HT的改變有關(guān)〔14〕。目前臨床資料已經(jīng)證實(shí)睡眠呼吸暫?;颊唧w內(nèi)5-HT水平發(fā)生變化,且這種變化與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)隨間歇性低氧時(shí)間的延長(zhǎng),動(dòng)物腦內(nèi)5-HT的含量降低,說(shuō)明5-HT參與睡眠呼吸暫停模式間歇性低氧對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理進(jìn)程。研究認(rèn)為〔16〕睡眠呼吸暫停模式的間歇缺氧造成的反復(fù)缺氧后再?gòu)?fù)氧,可引起神經(jīng)細(xì)胞能量代謝障礙、氧自由基損傷,導(dǎo)致單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT等合成和攝取,釋放紊亂,腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)5-HT降低。本研究中,給予GSP干預(yù)后,5-HT明顯改善,其表達(dá)水平呈劑量依賴式顯著增加,說(shuō)明GSP對(duì)睡眠呼吸暫停間歇性低氧大鼠腦內(nèi)5-HT水平有一定調(diào)節(jié)作用。這可能是GSP對(duì)OSAHS致工作記憶損傷的機(jī)制之一。

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        〔2014-08-07修回〕

        (編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

        《中國(guó)老年學(xué)雜志》被國(guó)際數(shù)家數(shù)據(jù)庫(kù)、檢索性期刊檢索機(jī)構(gòu)收錄情況

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        通訊作者:趙雅寧(1974-),女,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事老年病學(xué)研究。

        基金項(xiàng)目:河北省教育廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.ZH2012046)

        中圖分類號(hào)〔〕R364.4〔

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

        文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6722-03;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.034

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