林　威　陳素娟

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院干部病房，福建　福州　350001)

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坎地沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠A7r5細(xì)胞增殖的干預(yù)作用

林威陳素娟1

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院干部病房，福建福州350001)

摘要〔〕目的探討坎地沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠A7r5細(xì)胞增殖的干預(yù)作用。方法常規(guī)培養(yǎng)A7r5細(xì)胞，通過高糖5、15、20、30、40 mmol/L干預(yù)細(xì)胞6、12、24、36、48 h，以20 mmol/L高糖干預(yù)細(xì)胞再經(jīng)過濃度10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L坎地沙坦處理細(xì)胞48 h，并且設(shè)置對(duì)照組，四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)測(cè)定吸光度值(OD值)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血管緊張素(Ang)Ⅱ水平表達(dá)。結(jié)果高糖干預(yù)A7r5細(xì)胞6、12、24、36、48 h后，隨著高糖濃度升高OD具有上升趨勢(shì)，并且在高糖20 mmol/L、干預(yù)48 h時(shí)OD值最高?？驳厣程?jié)舛葹?、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L干預(yù)細(xì)胞48 h后，OD值逐漸降低，其中坎地沙坦?jié)舛葹?.001、0.000 1 mmol/L與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。高糖濃度20、30、40 mmol/L高糖濃度干預(yù)后AngⅡ水平較5 mmol/L干預(yù)時(shí)升高(P<0.05)；0、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L不同濃度坎地沙坦作用于20 mmol/L高糖誘導(dǎo)大鼠A7r5細(xì)胞48 h，AngⅡ水平逐漸降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論高糖可以誘導(dǎo)大鼠A7r5細(xì)胞增殖明顯上升、AngⅡ水平升高，但坎地沙坦干預(yù)后可以抑制A7r5細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞〔〕細(xì)胞增殖；A7r5細(xì)胞；坎地沙坦

1福建中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室

第一作者：林威(1976-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事老年醫(yī)學(xué)方面的研究。

糖尿病(DM)是心血管系統(tǒng)疾病的危險(xiǎn)因素，可能直接誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞變化等〔1〕。血管平滑肌細(xì)胞在AS中起著重要作用〔2〕?？驳厣程故沁x擇性血管緊張素(Ang)Ⅱ受體(AT1)拮抗劑，通過與血管平滑肌AT1受體結(jié)合而拮抗AngⅡ的血管收縮作用，從而降低末梢血管阻力〔3〕。本文旨在探討坎地沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞A7r5增殖的作用。

1資料與方法

1.1主要材料與儀器大鼠A7r5細(xì)胞購自上海生物試劑科技有限公司，HycloneDMEM無糖血清，Hyclone胎牛血清，胰酶消化液(0.25%Trypsin+0.02%EDTA)，噻唑藍(lán)(MTT，250 mg粉狀配置終濃度為5 mg/ml)；Baseclick 細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)試劑盒；大鼠AngⅡ酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自南京建成生物研究所；兔抗鼠一抗AT1購自碧云天生物技術(shù)研究所；山羊抗兔二抗購自碧云天生物研究所；高糖誘導(dǎo)劑購自南京生興生物技術(shù)有限公司；坎地沙坦(重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20041988，2010-04-08，規(guī)格8 mg)。美國寶特ELX-808 酶標(biāo)儀；倒置熒光顯微鏡。

1.2研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)大鼠A7r5細(xì)胞從凍存管中取出常規(guī)復(fù)蘇，置于12%胎牛血清中培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)瓶中4 ml，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，隔天換液。

1.2.2高糖誘導(dǎo)劑配置配置目標(biāo)母液濃度為0.5 mmol/L，稱取9 g高糖溶于100 ml超純水中，玻璃棒攪拌完全溶解后液氮罐低溫凍存殺菌，待用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置染毒濃度梯度：0(對(duì)照組)、5、15、20、30、40 mmol/L，配置采用無糖DMEM配置。

1.2.3干預(yù)藥物配置配置坎地沙坦母液終濃度為10 mmol/L，取坎地沙坦研缽研碎稱取5 mg，溶于11.3 ml的無糖DMEM中，濾器過濾，-20℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)設(shè)施濃度梯度：0(對(duì)照組)、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組96孔板上設(shè)置對(duì)照組；高糖誘導(dǎo)組；高糖誘導(dǎo)加干預(yù)藥物組，每個(gè)劑量組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。首先根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)篩選高糖誘導(dǎo)細(xì)胞增殖在0.8附近濃度，再控制高糖濃度行藥物干預(yù)，其中對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水干預(yù)。

1.2.5MTT測(cè)定細(xì)胞吸光度取對(duì)數(shù)期生長較好的大鼠A7r5細(xì)胞，經(jīng)過胰酶消化，計(jì)數(shù)后按照8 000個(gè)細(xì)胞/孔(200 μl)鋪于96孔板，板周圍應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)隔離，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，設(shè)置調(diào)零孔。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)等細(xì)胞鋪滿孔底70%，應(yīng)用5、15、20、30、40 mmol/L高糖誘導(dǎo)劑干預(yù)，將細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中6、12、24、36、48 h吸取培養(yǎng)，PBS沖洗2遍，每孔分別加入180 μl培養(yǎng)和20 μl MTT于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中4～6 h，吸取培養(yǎng)液加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)于酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(OD)，波長為550 nm，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率，分析細(xì)胞增殖達(dá)高峰時(shí)高血糖濃度和干預(yù)時(shí)間，確定濃度和時(shí)間后再由10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L坎地沙坦干預(yù)48 h，再次酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔-調(diào)零孔)/(對(duì)照組-調(diào)零孔)×100%。

1.2.6AngⅡ蛋白測(cè)定AngⅡ蛋白測(cè)定采用ELISA法，取對(duì)數(shù)期生長良好的A7r5 細(xì)胞，按照30×104個(gè)/孔鋪于6孔板中，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等細(xì)胞鋪滿70%時(shí)，分別應(yīng)用5、15、20、30、40 mmol/L高糖誘導(dǎo)劑干預(yù)，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，吸取上清液1 ml到1.5 ml EP管中待用，按照ELISA試劑盒步驟嚴(yán)格進(jìn)行測(cè)定AngⅡ蛋白水平。根據(jù)測(cè)定結(jié)果分析細(xì)胞增殖達(dá)高峰時(shí)血糖濃度，再由10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L坎地沙坦干預(yù)48 h，測(cè)定AngⅡ蛋白水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Dunnett-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1高糖對(duì)大鼠A7r5細(xì)胞增殖的影響不同濃度梯度高糖干預(yù)大鼠A7r5細(xì)胞6、12、24、36、48 h后，經(jīng)過MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示隨著高糖濃度升高OD具有上升趨勢(shì)，干預(yù)6 h時(shí)，高糖40 mmol/L；12 h，高糖20、30、40 mmol/L；24、36、48 h，高糖5、15、20、30、40 mmol/L，分別與對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且在高糖20 mmol/L，干預(yù)48 h時(shí)OD值最高。見表1。

高糖濃度(mmol/L)6h12h24h36h48h對(duì)照組0.41±0.050.40±0.020.41±0.040.41±0.030.42±0.0150.42±0.120.43±0.110.54±0.131)0.54±0.121)0.62±0.031)150.43±0.140.47±0.200.57±0.231)0.64±0.361)2)0.65±0.241)2)200.43±0.250.54±0.271)0.56±0.331)0.83±0.211)2)3)1.13±0.461)2)3)300.45±0.210.56±0.321)3)0.62±0.451)2)0.76±0.151)2)3)4)0.83±0.181)2)3)4)400.52±0.261)3)4)0.58±0.281)3)0.63±0.351)2)3)4)0.72±0.361)2)3)4)0.84±0.271)2)3)4)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與5 mmol/L組比較：2)P<0.05；與15 mmol/L組比較：3)P<0.05；與20 mmol/L組比較：4)P<0.05

2.2坎地沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞增殖干預(yù)作用不同濃度梯度坎地沙坦作用于20 mmol/L高糖誘導(dǎo)大鼠A7r5細(xì)胞48 h，經(jīng)過MTT檢測(cè)OD值，結(jié)果顯示坎地沙坦?jié)舛葹?、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/LOD值分別平均為(0.42±0.01)、(1.13±0.46)、(1.10±0.21)、(0.98±0.35)、(0.64±0.24)，其中坎地沙坦?jié)舛葹?.001、0.000 1 mmol/L與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3高糖誘導(dǎo)和梯度坎地沙坦干預(yù)后細(xì)胞增殖AngⅡ水平表達(dá)5、15、20、30、40 mmol/L高糖濃度干預(yù)細(xì)胞后，AngⅡ水平分別為(55.23±2.35)、(56.25±1.28)、(65.12±2.34)、(64.23±2.45)、(64.45±2.36)ng/L，其中20、30、40 mmol/L高糖濃度干預(yù)后AngⅡ水平較5 mmol/L干預(yù)時(shí)升高(P<0.05)；0、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L坎地沙坦作用于20 mmol/L高糖誘導(dǎo)大鼠A7r5細(xì)胞48 h，AngⅡ水平分別為(65.12±2.34)、(63.96±1.23)、(63.67±2.23)、(63.23±1.36)、(62.30±1.34)ng/L，各濃度間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

血管平滑肌細(xì)胞是血管壁重要組成部分，也是AS發(fā)生的重要變化細(xì)胞〔4〕。在AS形成過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞從血管壁逐漸遷移到血管膜，并且異常增生，血管逐漸變得狹窄，就會(huì)繼發(fā)血栓等栓塞性疾病，因此尋找抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的藥物或者成分對(duì)于預(yù)防和治療AS至關(guān)重要〔5〕。DM患者以長期的高血糖為主要表現(xiàn)形式，高血糖是心血管系疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素〔6〕，同時(shí)可以增加心臟的氧化應(yīng)激和升高炎癥因子的表達(dá)，逐漸引起血管功能下降〔7〕。對(duì)高血壓患者進(jìn)行的試驗(yàn)顯示〔8〕：患者多次服用坎地沙坦可致血漿腎素活性、AngⅠ濃度及AngⅡ濃度升高，2～8 mg/d連續(xù)用藥可以控制患者血糖水平，從而控制心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生〔9〕。另有研究表明坎地沙坦對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有明顯抑制作用，其機(jī)制可能與坎地沙坦調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，因此設(shè)想坎地沙坦對(duì)細(xì)胞增殖可能具有一定的抑制作用。

本文說明坎地沙坦對(duì)于A7r5細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用，可間接降低AS發(fā)生；同樣經(jīng)坎地沙坦處理后，AngⅡ水平也出現(xiàn)降低趨勢(shì)，從機(jī)制方面說明坎地沙坦具有一定抑制細(xì)胞增殖的作用，臨床其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)具有相同的研究結(jié)果〔10〕。坎地沙坦為AngⅡAT1受體拮抗劑，通過與血管平滑肌AT1受體結(jié)合而拮抗AngⅡ的血管收縮作用，從而降低末梢血管阻力，降低AS發(fā)生。但是對(duì)于坎地沙坦對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有一定的毒性或者長時(shí)間使用可能會(huì)產(chǎn)生哪些副作用，還不清楚，還需要進(jìn)一步的深入研究。

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〔2015-07-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

中圖分類號(hào)〔〕R58〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7049-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.036