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高分辨率熔解曲線分析法檢測(cè)大腸埃希菌gyrA基因突變

隨著喹諾酮類(lèi)藥物在臨床和畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用，大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物已呈現(xiàn)相當(dāng)高的耐藥率[1-2]。gyrA基因突變?cè)斐傻腄NA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位(GyrA)結(jié)構(gòu)改變是大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的最重要機(jī)制[3-4]。目前對(duì)gyrA突變的研究方法有：擴(kuò)增喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance determining region，QRDR)后基因測(cè)序分析、限制性?xún)?nèi)切酶Hinf Ⅰ的酶切進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single-strand conformation polymorphism， SSCP)分析等方法[5-8]。這些方法需有專(zhuān)門(mén)的設(shè)備,檢測(cè)費(fèi)用昂貴，操作煩瑣,需要一定的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，并且都存在一定的檢測(cè)局限性。高分辨率熔解曲線(high-resolution melting， HRM) 分析技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)新技術(shù)。用新型飽和染料(LC Green、LC Green PLUS、SYTO 9和Eva Green等)代替?zhèn)鹘y(tǒng)熔解曲線分析中的非飽和染料SYBER GreenN對(duì)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，根椐溶解溫度(melting temperature,Tm)值和熔解曲線的峰形來(lái)分析擴(kuò)增的目的基因,有非常高的靈敏度，且不需要專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)設(shè)備，在一些加裝了分析模塊的常規(guī)定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction， PCR)儀上也可以檢測(cè)分析。目前HRM技術(shù)已被應(yīng)用于基因分型、序列匹配、突變掃描等領(lǐng)域，有著廣泛的應(yīng)用前景。為了探索HRM技術(shù)檢測(cè)大腸埃希氏菌的gyrA基因突變的可行性，我們采用序列分析法和HRM技術(shù)分別檢測(cè)了70株臨床分離的大腸埃希菌gyrA基因的突變情況。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

70株大腸埃希菌均分離自2010年2月至2011年8月連云港市第一人民醫(yī)院臨床標(biāo)本, 包括尿液、痰、血標(biāo)本和其它標(biāo)本,排除重復(fù)菌株。所有菌株均經(jīng)西門(mén)子MicroScan WalkAway-96 Plus 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀鑒定，其中環(huán)丙沙星敏感38株、耐藥32 株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，均購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心。

二、 方法

1.大腸埃希菌gyrA基因QRDR的突變檢測(cè)參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增所有70株大腸埃希菌株gyrA基因的QRDR片段，引物序列為F: 5′-CTCCTATCTGGATTATGCG-3′、R：5′-GGTCGATAGAACCGAAGTTA-3′，由上海生工生物有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為284 bp,位于QRDR的第19～113位密碼子。PCR反應(yīng)混合體系Perfect ShotTMTaq購(gòu)自寶生物工程大連有限公司。GeneAmp 2700 PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)PE公司產(chǎn)品。菌株DNA提取參考文獻(xiàn)[9]稍作改動(dòng)：挑取一營(yíng)養(yǎng)瓊脂37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)的中等大小菌落于50 μL無(wú)菌蒸餾水中，95 ℃ 10 min裂解細(xì)菌，釋放DNA，10 000×g離心10 min，取上清液作為DNA模板。PCR擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[8],循環(huán)數(shù)為30次。將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測(cè)序，測(cè)得序列用blast 軟件與敏感株K011(Genbank登記號(hào)：CP002516.1)做序列比對(duì)，檢測(cè)是否有突變、突變位點(diǎn)及堿基變化。

結(jié)果

一、gyrA基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)70株大腸埃希菌gyrA基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增并測(cè)序。結(jié)果顯示共有43株(61.4%)gyrA基因發(fā)生突變,有27株(30.6%)為未突變的野生株，突變發(fā)生在83位密碼子TCG→TTG、85位密碼子GTT→GTC、87位密碼子GAC→AAC及91位密碼子CGT→CGC 4個(gè)位點(diǎn)，其中單一位點(diǎn)突變11株，多位點(diǎn)突變32株。依椐gyrA基因突變的不同位點(diǎn)數(shù)和類(lèi)型將70株菌株分成野生(未發(fā)生突變)和Ⅰ(24株，2點(diǎn)突變)、Ⅱ(15株，1點(diǎn)突變)、Ⅲ(14株，3點(diǎn)突變)、Ⅳ(2株，4點(diǎn)突變)、Ⅴ(2株，2點(diǎn)突變)5個(gè)組,見(jiàn)圖1、圖2及表1。

圖1　部分菌株gyrA基因普通PCR擴(kuò)增電泳圖

二、gyrA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析結(jié)果

gyrA基因突變株HRM與未發(fā)生突變的野生株有明顯差異，可以準(zhǔn)確區(qū)分野生株和突變株，準(zhǔn)確率達(dá)98.6%(69/70); 43株gyrA基因突變株檢出42株,敏感性為97.7%(42/43),其中只發(fā)生1個(gè)堿基突變的11株突變株(Ⅱ組)均被正確檢出。檢出的42株突變株按不同突變類(lèi)型被正確分組。見(jiàn)圖3、圖4。

三、gyrA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm檢測(cè)結(jié)果

注：箭頭示處為突變位點(diǎn)

圖2　發(fā)生多點(diǎn)突變位的gyrA基因測(cè)序圖

圖3　70株大腸埃希菌溶解曲線標(biāo)準(zhǔn)化圖形

圖4　70株大腸埃希菌溶解曲線標(biāo)準(zhǔn)化溫度差異圖形

圖5　70株大腸埃希菌的Tm峰形圖

討論

促旋酶A亞單位編碼基因gyrA突變而導(dǎo)致促旋酶結(jié)構(gòu)改變是大腸埃希菌耐喹諾酮類(lèi)藥物的最重要機(jī)制，改變主要位于編碼67～106氨基酸的密碼子之間,這個(gè)區(qū)間通常稱(chēng)為QRDR。對(duì)應(yīng)的gyrA基因最常見(jiàn)的突變?yōu)?3位密碼子TCG→TTG、87位密碼子GAC→AAC、91位密碼子CGT→CGC等[5,11]。研究表明突變的類(lèi)型不同和突變點(diǎn)的多寡對(duì)于喹諾酮類(lèi)藥物的MIC值有明顯影響[4]。

目前,研究gyrA突變的方法中以測(cè)序法最為可靠也最準(zhǔn)確，能夠確定突變的類(lèi)型和位置，但是需有基因測(cè)序設(shè)備，且檢測(cè)費(fèi)用昂貴。RFLP法主要利用gyrA基因突變中最常見(jiàn)為的83位密碼子堿基C→T突變的特點(diǎn)，但是突變?nèi)绮皇前l(fā)生在83位密碼子上就可能發(fā)生漏檢。SSCP是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)電泳分離的。這種方法的不足是某些位置的點(diǎn)突變對(duì)單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小，再加上其它條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無(wú)法分辨造成漏檢。這幾種方法都需要一定的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，而且都是2個(gè)步驟的分析，操作較為煩瑣且較易發(fā)生樣本污染，所以都存在一定的局限性。

HRM分析法是用新型飽和染料代替?zhèn)鹘y(tǒng)熔解曲線分析中的非飽和染料對(duì)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析[12]。該檢測(cè)技術(shù)近年來(lái)已應(yīng)用于臨床微生物檢驗(yàn)中的菌種鑒定、耐藥機(jī)制檢測(cè)等多個(gè)研究領(lǐng)域[13-16]。它主要根椐突變株發(fā)生堿基突變后DNA的GC含量與野生株不同而導(dǎo)致的Tm值和熔解曲線峰形的差異，通過(guò)基因掃描敏感地鑒別突變株和野生株的DNA。從已有的研究報(bào)道和前期的測(cè)序結(jié)果表明：大腸埃希菌gyrA基因最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)均由堿基G或C突變?yōu)門(mén)或A。由于DNA的GC含量發(fā)生了改變，必然會(huì)導(dǎo)致DNA的Tm值和熔解曲線峰形發(fā)生改變，這就使HRM技術(shù)快速檢測(cè)出大腸埃希菌gyrA基因突變成為可能。2007年，SLINGER 等[10]報(bào)道了將HRM技術(shù)應(yīng)用于沙門(mén)氏菌gyrA基因的突變檢測(cè)，成功檢測(cè)出了臨床分離的沙門(mén)氏菌gyrA突變株。但SLINGER等[10]研究發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌gyrA基因只是單位點(diǎn)的突變。然而本研究對(duì)臨床分離的70株大腸埃希菌gyrA基因測(cè)序表明：大腸埃希菌的gyrA基因突變有單位點(diǎn)、雙位點(diǎn)、多位點(diǎn)突變的情況存在，突變型遠(yuǎn)較沙門(mén)氏菌復(fù)雜。本研究運(yùn)用HRM技術(shù)對(duì)臨床分離的70株大腸埃希菌gyrA基因突變進(jìn)行檢測(cè)，與基因測(cè)序法相比正確率達(dá)到98.6%(69/70),對(duì)檢測(cè)出的42株突變株的突變型能正確地鑒別分組。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程從挑取細(xì)菌單菌落制備模板DNA、試劑準(zhǔn)備、熒光定量PCR擴(kuò)增到熔解曲線分析可在1～2 h內(nèi)完成，1次最多可完成96個(gè)樣本檢測(cè)，符合微生物快速診斷的發(fā)展以及大樣本檢測(cè)的要求。如果在檢測(cè)過(guò)程中加入已知突變位點(diǎn)和突變型的菌株作參考菌株，將待檢菌株的分析曲線或Tm值與參考菌株作比較可以直接檢測(cè)出待檢菌的突變點(diǎn)和突變類(lèi)型，無(wú)需做后續(xù)的基因測(cè)序，成本低廉。且由于檢測(cè)為封閉不開(kāi)蓋連續(xù)檢測(cè)，避免了樣本污染，擴(kuò)增產(chǎn)物還可以用來(lái)做其它實(shí)驗(yàn)分析。本研究顯示HRM技術(shù)檢測(cè)大腸埃希菌gyrA基因突變具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確優(yōu)點(diǎn)，可以作為檢測(cè)大腸埃希菌耐藥機(jī)制的新選擇。由于本研究檢測(cè)的樣本數(shù)不夠多，因此利用HRM技術(shù)檢測(cè)大腸埃希菌gyrA基因突變的可行性還需要加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

由于HRM技術(shù)是基于突變菌株DNA中GC含量發(fā)生改變的原理，所以當(dāng)細(xì)菌基因發(fā)生多位點(diǎn)突變，且多個(gè)突變的GC改變相互抵消導(dǎo)致發(fā)生突變后的DNA的GC含量與野生株相同的情況下，HRM技術(shù)就無(wú)法正確檢測(cè)到這種突變。本研究第Ⅳ組菌株由于發(fā)生了4個(gè)位點(diǎn)突變， 突變的堿基改變相互抵消后DNA與野生株相比堿基改變?yōu)镚→A 、T→C，無(wú)明顯GC含量改變，Tm值(83.96)變化不大，造成有一株菌的突變沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)，這是HRM技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌基因多位點(diǎn)突變的方法學(xué)的局限性。

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茆海豐，劉洪書(shū)

(連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 連云港 222002)

摘要：目的探討高分辨率溶解曲線(HRM)分析法在檢測(cè)大腸埃希菌gyrA基因突變中的可行性。方法收集臨床非重復(fù)分離的大腸埃希菌70株，常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增大腸埃希菌的gyrA基因，采用序列分析法檢測(cè)gyrA基因的變異情況。設(shè)計(jì)特異性引物，采用熒光定量PCR擴(kuò)增這70株大腸埃希菌株的gyrA基因，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析和熔解溫度(Tm)值測(cè)定確定gyrA基因變異情況。將檢測(cè)結(jié)果與序列分析法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果基因測(cè)序顯示70株大腸埃希菌中有43株gyrA基因發(fā)生了突變，突變類(lèi)型分為5型。HRM分析法可以準(zhǔn)確區(qū)分野生株和突變株，準(zhǔn)確率達(dá)98.6%(69/70),正確檢測(cè)出了43株突變菌株中的42株，且對(duì)不同的突變類(lèi)型準(zhǔn)確分型。Tm分析顯示野生株和突變株之間以及各種突變型之間有明顯差異。結(jié)論HRM技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、簡(jiǎn)單、快速、成本低廉、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可以作為檢測(cè)大腸埃希氏菌gyrA基因突變耐藥機(jī)制的新選擇。

關(guān)鍵詞：大腸埃希菌; gyrA基因; 高分辨率熔解曲線

The detection ofgyrAgene mutation inEscherichiacoliby high-resolution melting analysisMAOHaifeng，LIUHongshu.(TheFirstPeople′sHospitalofLianyungangCity,JiangsuLianyungang222002,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of high-resolution melting (HRM) analysis to detect gyrA gene mutation in Escherichia coli. MethodsA total of 70 isolates of Escherichia coli were collected, and gyrA gene was amplified with conventional polymerase chain reaction(PCR). Gene mutation was detected by sequence analysis. Specific primer was designed. The gyrA gene was amplified by fluorescence quantitation PCR. The mutation of gyrA gene was detected by amplifying product HRM curve and melting temperature (Tm) analysis. The result was compared with that of gene sequence analysis. ResultsgyrA gene mutation sequence analysis showed that 43 of 70 isolates occurred gyrA gene mutation. In these mutations, 5 types were found. HRM analysis can accurately distinguish between wild and mutant isolates. The detection accuracy was 98.6% (69/70).The 42 of 43 mutant isolates were correctly detected, and different type gene mutations can be correctly typed. Tm analysis also showed the difference of wild and mutant isolates. ConclusionsHRM analysis is accurate, simple, rapid, cheap and high-throughput, and it and would be a novel choice in analyzing drug resistance mechanism of Escherichia coli.

Key words:Escherichia coli; gyrA gene; High-resolution melting

收稿日期：(2015-01-12)

作者簡(jiǎn)介：茆海豐，男，1969年生，碩士，主任技師，主要研究方向?yàn)榧?xì)菌耐藥機(jī)制。

基金項(xiàng)目：江蘇省連云港市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(11014)

中圖分類(lèi)號(hào)：(本文編輯：范基農(nóng))

文章編號(hào)：1673-8640(2015)11-1138-05Q503 1673-8640(2015)11-1143-04R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.018 ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.019