周敬綱

[摘要] 目的 了解動物源性大腸埃希菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的檢出率和耐藥特點，為其耐藥性的安全評價提供依據(jù)。 方法 采用NCCLS推薦的表型檢測法和確認試驗測定大腸埃希菌ESBLs，紙片擴散法測定大腸埃希菌的耐藥性。 結果 222株大腸埃希菌對環(huán)丙沙星（83.78%）、諾氟沙星（92.79%）、利福平（81.08%）的耐藥率很高；對阿米卡星、亞胺培南高度敏感。ESBLs檢出率為12.16%（27/222），產(chǎn)ESBLs菌株除對亞胺培南外其余13種抗生素的耐藥率均高于非產(chǎn)ESBLs菌株。 結論 動物源性大腸埃希菌對很多抗生素具有一定的耐藥性，應加強對食品中動物源性大腸埃希菌耐藥性的監(jiān)測。

[關鍵詞] 大腸埃希菌；動物源食品；耐藥性

[中圖分類號] R378.2+1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）12（b）-0008-04

食品安全是全世界普遍關注的問題，其關系到人民群眾的身體健康和生命安全。近年來，由于抗生素的濫用，出現(xiàn)越來越多的耐藥菌株，且耐藥譜越來越廣[1]，對感染性疾病的臨床治療構成威脅。大腸埃希菌是食品污染監(jiān)測的主要指標菌，是人類和動物腸道中的正常棲居菌，具有致病性，條件致病性和非條件致病性等多樣性特點，臨床上，大腸埃希菌引起感染的現(xiàn)象日趨嚴重，耐藥菌株不斷增多，其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）大腸埃希菌是對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要病原菌。在動物源性食品的加工過程中，很容易受到大腸埃希菌的污染，并傳遞給人類，因此對動物源性大腸埃希菌耐藥性和ESBLs檢測具有重要意義。本文通過對食品污染風險監(jiān)測中由動物源性食品中分離到的大腸埃希菌進行藥敏試驗，了解本地動物源性食品中大腸埃希菌的耐藥性和ESBLs的產(chǎn)生情況，為臨床抗生素應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2011年6月～2013年9月食品污染風險檢測中源自雞源、豬源、牛源食品中的大腸埃希菌222株，其中雞肉源72株，雞蛋源53株、豬肉源82株、牛肉源10株、生牛奶源5株。

1.2 菌株的分離程序

1.2.1 樣品的稀釋 取動物源食品25 g放入盛有225 ml磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min制成1∶10的樣品勻液。調(diào)pH值至6.5～7.5。用1 ml無菌吸管吸取1∶10樣品勻液1 ml，沿管壁緩緩注入9 ml磷酸鹽的緩沖液，混勻，制成1∶100的樣品勻液。根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。

1.2.2 初發(fā)酵試驗 選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1 ml，（36±1） ℃培養(yǎng)（24±2） h，產(chǎn)氣管進行復發(fā)酵試驗。

1.2.3 復發(fā)酵試驗 用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于已提前預溫至45℃的EC肉湯管中，放入帶蓋的（44.5±0.2） ℃水浴箱內(nèi)，水浴的水面應高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)（24±2） h，產(chǎn)氣管，進行EMB平板分離培養(yǎng)。

1.2.4 EMB平板分離 用接種環(huán)取培養(yǎng)物劃線接種于EMB平板，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，挑取具黑色中心有金屬光澤或無金屬光澤的典型菌落進行鑒定。

1.2.5 鑒定 IMViC實驗，選取結果為﹢﹢﹣﹣、﹣﹢﹣﹣、﹢﹢﹣﹢、﹣﹢﹣﹢的目標菌落進行ESBLs檢測和藥敏試驗。

1.3 ESBLs檢測

ESBLs表型檢測方法，采用美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的標準紙片瓊脂擴散法，確認試驗采用雙紙片法，抗生素為頭孢他定30 μg，頭孢他定/克拉維酸30 μg/10 μg，頭孢噻肟30 μg，頭孢噻肟/克拉維酸30 μg/10 μg。培養(yǎng)基為M-H瓊脂。結果判讀：任何一種藥物在加入克拉維酸后，抑菌圈直徑與不加入克拉維酸的抑菌圈相比增大值≥5 mm，判斷為產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌。

1.4 藥敏試驗

采用VITEK32細菌鑒定儀對分離菌株進行鑒定，紙片擴散法（K-B法）進行藥敏試驗，藥敏試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC25922）。抗生素選擇如下。青霉素類：氨芐西林（AMP）；頭孢菌素類：頭孢噻吩（CFT）、頭孢曲松（CTX）；氨基糖苷類：慶大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）；四環(huán)素類：四環(huán)素（TET）、強力霉素（DOTC）；氯霉素類：氯霉素（CHL）；磺胺類：甲氧芐啶（TRI）；甲氧芐啶/磺胺甲唑（SXT）；喹諾酮類：環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）；碳青霉烯類：亞胺培南（IPM），其他：利福平（RIF）。試驗結果按NCCLS標準判定。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果

222株大腸埃希菌對CIP（83.78%）、NOR（92.79%）、RIF（81.08%）的耐藥率很高；對GEN（32.43%）、SXT（12.16%）耐藥率較高；對AMP（9.01%）、CFT（6.31%）、CTX（4.95%）、TET（7.21%）、DOTC（4.50%）、CHL（5.41%）、TRI（3.60%）的耐藥率介于3.60%～9.01%；對AMK（0.90%）、IPM（0.00%）高度敏感。豬肉源和牛肉源大腸埃希菌對GEN的耐藥率相對較高，達到60.98%、100.00%（表1）。

表1 動物性食品源大腸埃希菌對14種抗生素的耐藥率[株（%）]

2.2 動物性食品源大腸埃希菌ESBLs檢測結果

222株大腸埃希菌中ESBLs檢出率為12.16%（27/222）。樣品ESBLs分布：雞肉源12.5%（9/72），雞蛋源11.3%（6/53）、豬肉源12.2%（10/82）、牛肉源10.0%（1/10）、生牛奶源20.0%（1/5）。

2.3 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥率的比較

除IPM外，產(chǎn)ESBLs菌株對其他13種抗菌藥物的耐藥率均明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株（P<0.05）（表2）。

表2 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥率的比較 [株（%）]

3 討論

大腸埃希菌為革蘭氏陰性短桿菌，是人和動物腸道中的正常棲居菌，分為致病性大腸埃希菌和非致病性大腸埃希菌，后者又稱為普通大腸埃希菌，是人和動物腸道中兼性厭氧正常菌群的優(yōu)勢菌種，通常對機體無害。當在外界環(huán)境發(fā)生變化、機體免疫力下降或其他病原菌感染等條件下，可引起繼發(fā)感染。隨著對其所致疾病研究的增多，發(fā)現(xiàn)其所致感染性疾病居各種常見細菌性感染疾病的首位[2]，由于抗生素濫用，近年來動物和人類大腸埃希菌的耐藥性逐漸增高[3]，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)過程中，無論抗菌藥物是作為治療用還是作為促生長劑用，在抗菌藥物的選擇性壓力下，腸道細菌很易產(chǎn)生耐藥性變化[4-6]。

研究表明動物源性大腸埃希菌的耐藥率與養(yǎng)殖場抗菌藥的使用劑量、頻率存在很強的相關性[7]。本試驗結果顯示，動物源性食品大腸埃希菌對動物常用抗生素CIP、NOR、RIF的耐藥率很高，達到81.08%～92.79%；對AMP、CFT、CTX、TET、DOTC、CHL、TRI的耐藥率介于3.60%～9.01%；對AMK和IPM高度敏感。與人類臨床大腸埃希菌耐藥性不盡相同[8-10]，耐藥性CIP、RIF高于臨床，敏感性IPM、AMK與臨床相似，其余抗生素臨床分離大腸埃希菌菌株的耐藥性要高于本實驗結果。研究表明動物源性食品分離的大腸埃希菌已對多種抗生素具有一定的耐藥性，提示動物臨床用藥應根據(jù)藥敏試驗結果，有針對性地使用，同時要首選不容易誘導細菌產(chǎn)生耐藥性的藥物，而且必須經(jīng)常更換抗生素種類，以免產(chǎn)生新的耐藥菌株。

ESBLs是一類能水解廣譜青霉素，第三代頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，使產(chǎn)酶菌在有β-內(nèi)酰胺酶抗生素存在條件下能繼續(xù)生存，但對碳青霉烯類及酶類抑制劑敏感。另外，產(chǎn)ESBLs菌不僅對第三代頭孢菌素和氨曲南耐藥，而且對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類抗菌藥物也可交叉耐藥，所以產(chǎn)ESBLs細菌的治療已成為臨床上一大難題，其耐藥基因可以通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導等形式在同種屬，甚至不同種屬間傳遞，造成耐藥性在細菌間傳播[11]，給臨床感染的控制帶來困難。雖然本試驗ESBLs檢測結果（12.16%）低于臨床菌株（41.42%～69.2%）[8-10，12]，但說明在動物源性食品中大腸埃希菌具有一定的ESBLs菌株，應引起重視。產(chǎn)ESBLs菌株對除IPM外其余13種抗生素的耐藥率高于非產(chǎn)ESBLs菌株（P<0.05），與臨床相似[8]，表現(xiàn)為ESBLs陽性菌較ESBLs陰性菌具有較高耐藥性[13]。

試驗結果顯示，動物源性大腸埃希菌對很多抗生素已具有一定的耐藥性。盡管目前尚無有力證據(jù)證明動物源性食品耐藥大腸埃希菌菌株可以通過食物鏈誘發(fā)人體疾病，但是攝入人體的動物性食品源耐藥大腸埃希菌菌株把人體腸道作為臨時寄居地，很可能把耐藥基因轉(zhuǎn)移至人體腸道正常菌群中，這種耐藥基因在細菌間傳播，是多重耐藥病原菌不斷產(chǎn)生的重要原因[11，14]，腸道菌群，尤其是大腸埃希菌在溫血動物腸道內(nèi)密度大，被認為是食源性腸道病原菌多重耐藥基因的主要儲存庫[15]，攜帶耐藥基因的大腸埃希菌與共生的沙門菌、致病性大腸埃希菌及其他腸道病原菌通過可移動基因元件的轉(zhuǎn)移進行基因物質(zhì)的交換[16-18]，使各種藥物敏感菌產(chǎn)生耐藥性，甚至引起“超級細菌”的產(chǎn)生，有報道顯示，自鏈霉素作為助長劑應用于畜牧生產(chǎn)時，大腸埃希菌中出現(xiàn)控制耐藥性可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，這種質(zhì)粒曾在豬、飼養(yǎng)員及其家人分離的大腸埃希菌中被發(fā)現(xiàn)，也在人群腸道分離的大腸埃希菌中被發(fā)現(xiàn)[19]，但這些人群從未與養(yǎng)豬場接觸，只是住同一地區(qū)[20]，這提示耐藥菌質(zhì)粒可以從動物性食品以食物鏈的方式傳入人體。

總之，作為大腸埃希菌耐藥性菌株產(chǎn)生的主要來源之一，應加強動物源性食品大腸埃希菌的耐藥性檢測，為相關從業(yè)者和部門提供參考依據(jù)，減少動物源性食品作為耐藥病原菌的潛在“蓄水池”。

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（收稿日期：2014-10-09 本文編輯：李亞聰）