朱宇清，　朱　俊，　徐　翀

(上海市臨床檢驗中心，上海 200126)

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流式細胞術淋巴細胞亞群檢測室間質(zhì)評結果分析

朱宇清，朱俊，徐翀

(上海市臨床檢驗中心，上海 200126)

摘要：目的通過分析衛(wèi)生部臨床檢驗中心、上海市臨床檢驗中心的淋巴細胞亞群室間質(zhì)量評價(EQA)報告數(shù)據(jù)以及上海市2家實驗室室內(nèi)質(zhì)控上報數(shù)據(jù)，探討目前國內(nèi)淋巴細胞亞群檢測EQA評判規(guī)則的合理性，為進一步提高國內(nèi)該檢測項目的質(zhì)量水平提供依據(jù)。方法對BD流式細胞儀用戶組2014年衛(wèi)生部臨床檢驗中心及2015年上海市臨床檢驗中心第1次淋巴細胞亞群EQA報告數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計算各濃度質(zhì)評樣本上報數(shù)據(jù)的標準差(s)和變異系數(shù)(CV)，選取上海市2家BD流式細胞儀用戶2014年9月至2015年4月期間的淋巴細胞亞群室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)，計算月s和月CV值。并對衛(wèi)生部臨床檢驗中心第201403和201405號質(zhì)評樣本CD3+CD4+百分比(CD3+CD4+%)項目(靶值分別為42.7%、42.1%)、上海市臨床檢驗中心第1521和1525號質(zhì)評樣本 CD3+CD4+%項目(靶值分別為43.2%，44.13%)的回報數(shù)據(jù)以及2家上海市臨床實驗室CD3+CD4+%項目中值水平(月組均值為44.39%～46.80%)室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)進行比較分析。結果2014衛(wèi)生部臨床檢驗中心5份EQA樣本的s為1.10%～1.55%，CV為3.1%～5.5%，平均CV為3.36%；2015年上海市臨床檢驗中心第1次EQA 5份樣本的s為0.67%～1.63%，CV為3.51%～8.64%，平均CV為4.83%。在樣本CD3+CD4+%值相近的情況下，衛(wèi)生部臨床檢驗中心2個EQA樣本組s(1.55%、1.35%)和組CV(3.6%、3.2%)、上海市臨床檢驗中心2個EQA樣本的組s(1.63%、1.55%)和組CV(3.78%、3.51%)均在上海市2家臨床實驗室室內(nèi)質(zhì)控月s(1.06%～2.44%、0.98%～2.03%)和月CV(2.18%～5.28%、2.14%～4.35%)的變化范圍之內(nèi)。結論由于儀器品牌和型號、溶血方法、熒光抗體的品牌和用量、設門方法、實驗人員、環(huán)境條件等不同因素的影響，EQA數(shù)據(jù)統(tǒng)計中的s和CV低于室內(nèi)質(zhì)控的s和CV不合理。其原因可能是部分參與EQA的實驗室在數(shù)據(jù)上報前對檢測結果進行了交流、核對和更改。當前除了加強對實驗室的質(zhì)量教育外，EQA組織者還需要探討建立更合適的質(zhì)控規(guī)則。

淋巴細胞亞群檢測對影響機體免疫系統(tǒng)的多種因素的診斷和監(jiān)測提供了重要信息。上世紀80年代，研究者發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)因破壞CD4+T細胞而導致獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，此發(fā)現(xiàn)也成為流式細胞術從研究工具轉(zhuǎn)變?yōu)槌Ｒ?guī)診斷技術的原動力[1]，同時也激勵科學家和臨床病理學家迅速建立了多種準確、可靠的CD4+T細胞百分比和絕對計數(shù)的方法[2]，也激發(fā)了臨床實驗室對淋巴細胞亞群檢測的室間質(zhì)量評價(external quality assessment, EQA)需求的增加，促使一系列國際間協(xié)作研究組織的誕生。目前，我國衛(wèi)生部臨床檢驗中心和上海市臨床檢驗中心也已建立了淋巴細胞亞群檢測的EQA計劃，為提高國內(nèi)各實驗室的檢測準確度起到了積極作用。我們對2014年衛(wèi)生部臨床檢驗中心流式細胞術-淋巴細胞亞群EQA數(shù)據(jù)以及2015年上海市臨床檢驗中心第1次流式細胞術-淋巴細胞亞群EQA數(shù)據(jù)進行分析，并結合上海市2家實驗室該項目的室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)，探討國內(nèi)實驗室可能存在的問題或趨勢。

材料和方法

由于國內(nèi)開展CD4+T細胞絕對計數(shù)的實驗室數(shù)量很少，上海市開展絕對計數(shù)的實驗室僅為5家，故僅對CD4+T細胞百分比(CD3+CD4+%)結果進行探討。本研究所采用的數(shù)據(jù)包括2014年衛(wèi)生部臨床檢驗中心淋巴細胞亞群BD儀器組EQA數(shù)據(jù)、2015年上海市臨床檢驗中心第1次流式細胞術-淋巴細胞亞群BD儀器組EQA數(shù)據(jù)以及上海市2家BD儀器組臨床實驗室自2014年9月至2015年4月的室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)。

結果

一、 2014年衛(wèi)生部臨床檢驗中心淋巴細胞亞群EQA數(shù)據(jù)

二、 2015年上海市臨床檢驗中心第1次流式細胞術-淋巴細胞亞群EQA數(shù)據(jù)

2015年上海市臨床檢驗中心第1次EQA樣本編號為1521～1525，共5份。按回報數(shù)據(jù)計算出BD儀器組的s和CV，見表2。5份EQA樣本的s為0.67%～1.63%，CV為3.51%～8.64%，平均CV為4.83%。

表1　2014年衛(wèi)生部臨床檢驗中心淋巴細胞

三、上海市2家臨床實驗室室內(nèi)質(zhì)控上報數(shù)據(jù)

表2　2015年上海市臨床檢驗中心第1次

表3　實驗室A和B流式細胞術-淋巴細胞亞群室內(nèi)質(zhì)控上報數(shù)據(jù)　(%)

四、數(shù)據(jù)比較

在樣本CD3+CD4+%值相近的情況下，衛(wèi)生部臨床檢驗中心2個EQA樣本和上海市臨床檢驗中心2個EQA樣本的組s值和組CV值均在上海市2家臨床實驗室室內(nèi)質(zhì)控月s和月CV的變化范圍之內(nèi)。說明衛(wèi)生部臨床檢驗中心和上海市臨床檢驗中心EQA的s值和CV值低于一些臨床實驗室室內(nèi)質(zhì)控的月s值和CV值。

討論

實驗室參加EQA活動可以從中獲得如下益處：通過EQA可以確認并監(jiān)測實驗室的檢測能力，能幫助實驗室確定所采用的檢測方法的準確度并識別檢測方法中存在的問題，教育員工并建立信心，監(jiān)測員工的能力等。但這些都應基于EQA能夠科學、準確地反映所有參加者能力水平的真實情況。

本研究發(fā)現(xiàn)流式細胞術-淋巴細胞亞群EQA有部分數(shù)據(jù)的s和CV低于實驗室室內(nèi)質(zhì)控的s和CV。流式細胞術檢測項目所具有的特殊性決定了其受到的影響因素多于其他常規(guī)的生化和免疫的定量檢測項目。其影響因素及其對室內(nèi)質(zhì)控和EQA的不同作用見表4。

綜合上述信息來看，上海市的2家臨床實驗室按規(guī)定進行室內(nèi)質(zhì)控樣本檢測并定期如實上報室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)，操作人員具有較強的質(zhì)量控制意識；相對而言，國內(nèi)還有相當一部分實驗室并未能做到每次進行淋巴細胞亞群檢測工作的同時進行室內(nèi)質(zhì)控樣本的檢測，質(zhì)控意識較為薄弱。因此，EQA的s和CV低于實驗室A和B的室內(nèi)質(zhì)控s和CV的原因可能是EQA數(shù)據(jù)并未能夠反映參與EQA的實驗室的實際情況。

另外，根據(jù)國外相關機構組織的淋巴細胞亞群檢測EQA計劃的經(jīng)驗來看，參與實驗室之間的s和CV的減小也需經(jīng)歷相應的過程。

在穩(wěn)定化處理的質(zhì)控血研制成功之前，EQA樣本為新鮮全血。根據(jù)上世紀90年代初已發(fā)表的多中心協(xié)作研究報道，對于HIV陰性新鮮全血樣本的CD4+T細胞百分比(CD4+%)項目，可接受的CV值是<15%[3-4]。

表4　各種影響因素對室內(nèi)質(zhì)控和EQA的作用差異

自1990年起，國際上就已逐步建立了數(shù)種流式細胞術檢測淋巴細胞亞群的方法。由于臨床決斷對于淋巴細胞亞群檢測結果的依賴性日益提高，針對淋巴細胞亞群計數(shù)的國家和國際指南以及EQA計劃陸續(xù)建立[8]。GLENCROSS等[9]報道在4年里同時采用非洲地區(qū)室間質(zhì)量評價計劃(African Regional External Quality Assessment Scheme, AFREQAS)和QASI質(zhì)評樣本共進行了20輪試驗。當各參與實驗室使用各自常規(guī)使用的方法時，對于中值CD4+T細胞的質(zhì)評樣本，AFREQAS實驗室間平均CV為7.3%、QASI的CV為8.8%。對于低值CD4+T細胞質(zhì)評樣本，AFREQAS的CV為10.7%、QASI的CV為15.1%。而如果參與實驗室采用相同檢測方法，如全白細胞設門(panLeuco gating，PLG)檢測方法時，則CD4+T細胞中值樣本的CV為4.2%，低值樣本CV為5.5%。

HULTIN等[10]報道，在美國國家過敏和感染性疾病研究院AIDS部免疫學質(zhì)量評價(the National Institute of Allergy and Infectious Disease，Division of AIDS Immunology Quality Assessment, NIAID-IQA)能力驗證項目的主導下，采用未加穩(wěn)定劑的新鮮血液，連夜送往4家AIDS多中心隊列研究(multicenter AIDS cohort study, MACS)實驗室，確保在抽血之后30～36 h檢測。所有4家MACS實驗室自成立以來都已參加NIAID-IQA能力驗證項目，都采用免洗溶血素和CD45設門法。研究結果表明，即使使用未加穩(wěn)定劑的新鮮血液樣本，低值CD4+T細胞樣本的CV[中位數(shù)(四分位間距)]為3.7%(3.4%～6.6%)，中值CD4+T細胞樣本的CV[中位數(shù)(四分位間距)]為2.4%(1.5%～2.9%)，總體CV[中位數(shù)(四分位間距)]為2.8%(1.9%～3.7%)?？傮wCV明顯低于SCHNIZLEIN-BICK等[11]的研究結果(9%)。分析這2個研究結果的差異，原因是多方面的，但最重要的是樣本制備過程中使用了新的免洗溶血方法及CD45設門方法。自此，MACS下屬實驗室均統(tǒng)一使用免洗溶血素和CD45設門方法，淋巴細胞亞群檢測的CV因此可控制在較小的范圍內(nèi)。NIAID-IQA可接受標準為CD4+%和CD8+T細胞百分比項目室內(nèi)重復性CV≤3%，室間重復性CV<5%。而國內(nèi)實驗室檢測方法遠未達到統(tǒng)一，即使參與上海市臨床檢驗中心EQA活動的實驗室也未能統(tǒng)一使用免洗溶血素和CD45設門的檢測方法。

綜上所述，衛(wèi)生部臨床檢驗中心和上海市臨床檢驗中心的淋巴細胞亞群檢測EQA的s和CV低于臨床實驗室室內(nèi)質(zhì)控s和CV的情況存在不合理性，其原因可能是部分參與EQA的實驗室在數(shù)據(jù)上報前對檢測結果進行了交流、核對和更改。針對這樣的情況，能夠采取的較為適合的措施除了加強對實驗室的質(zhì)量教育外，EQA組織者還需要探討建立更合適的質(zhì)控規(guī)則以及設計防串通方案。比如在EQA樣本準備中，配置多于5個濃度水平的樣本，對于不同實驗室隨機選取不同濃度的組合；或?qū)?個不同濃度水平的樣本通過軟件將編號打亂發(fā)放等措施。

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(本文編輯：龔曉霖)

關鍵詞：淋巴細胞亞群；流式細胞術；室間質(zhì)量評價；標準差；變異系數(shù)

Analysis on the results of external quality assessment of lymphocyte subsets by flow cytometryZHUYuqing,ZHUJun,XUChong.(ShanghaiCenterforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the assessment rationality scheme of external quality assessment (EQA) for the analysis of lymphocyte subsets by comparing the data from the lymphocyte subset EQA in the National Center for Clinical Laboratory and Shanghai Center for Clinical Laboratory and the submitted data of internal quality control from 2 laboratories in Shanghai, in order to improve the analysis quality of lymphocyte subsets. MethodsThe data of BD flow cytometry group from the National Center for Clinical Laboratory EQA in 2014 and Shanghai Center for Clinical Laboratory EQA for the first time in 2015 were analyzed statistically, and the standard deviation (s) and coefficient of variation (CV) were calculated. The internal quality control data from 2 laboratories in Shanghai were collected from September 2014 to April 2015, and the s and CV were calculated. The CD3+CD4+percentage (CD3+CD4+%) data of Sample 201403 and Sample 201405 (target values: 42.7% and 42.1%) from the National Center for Clinical Laboratory, Sample 1521 and Sample 1525 (target values: 43.2% and 44.13%) from Shanghai Center for Clinical Laboratory and the submitted internal quality control data (monthly mean 44.39%- 46.80%) of 2 laboratories were analyzed comparatively. ResultsThe s and CV of 5 EQA samples from the National Center for Clinical Laboratory in 2014 were 1.10%-1.55% and 3.1%-5.5%, respectively, and the average CV was 3.36%. The s and CV of 5 EQA samples for Shanghai Center for Clinical Laboratory in 2015 were 0.67%-1.63% and 3.51%-8.64%, respectively, and the average CV was 4.83%. In the situation of data with approximate means, the group s (1.55% and 1.35%) and group CV (3.6% and 3.2%) from the National Center for Clinical Laboratory and the group s (1.63% and 1.55%) and group CV (3.78% and 3.51%) from Shanghai Center for Clinical Laboratory were less than those of internal quality control data from 2 laboratories (monthly s1.06%-2.44% and 0.98%-2.03%; monthly CV 2.18%-5.28% and 2.14%-4.35%). ConclusionsIt is irrational that the s and CV of EQA are less than those of internal quality control since different impacts from the factors such as instrument brands and models, lysis techniques, brands and volumes of antibodies, gating strategies, experimenters and environment conditions and so on. One of the possible reasons may be that some laboratories exchanged, checked and sometime modified the EQA data before submitting the data. Other than improving the quality education for the laboratories, the solution can be the establishment of rational marking scheme.

Key words:Lymphocyte subset; Flow cytometry; External quality assessment; Standard deviation; Coefficient of variation

收稿日期：(2015-07-07)

作者簡介：朱宇清，女，1967年生，碩士，副主任技師，主要從事免疫學檢驗及質(zhì)量控制研究。

基金項目：上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會資助項目(2013ZYJB0010)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)11-1086-05R446.63

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.007